Gene Targeting

von Bettina Ocker (Laborjournal-Ausgabe 03, 1995)

Gene Targeting: die Technik der Genetik der 90er Jahre !?

Ein jahrelanger Traum vieler Genetiker blieb der gezielte Einbau von Fremd-DNA in Eukaryonten. Mit Gene Targeting ist es heute möglich, sich den gewünschten Genotyp maßzuschneidern. Voraussetzung ist, daß die Sequenz des betreffenden Gens bekannt ist. Man kann dann einen Targetvektor basteln, der eine weitgehend homologe, aber inaktive Form dieses Gens enthält. Dabei erzeugt man beispielsweise innerhalb des Gens ein Stopcodon, das dann während der Translation zu einem Syntheseabbruch führt.

Manifestieren läßt sich die gesetzte Mutation über homologe Rekombination, indem man den Targetvector in pluripotente embryonale Stammzellen ( ES-Zellen ) transfektiert. Eine Resistenz gegen das Zellgift Neomycin erlaubt die Anreicherung gesuchter ES-Zellklone. Jetzt beginnt das Screening der richtigen Mutanten. Es stehen jetzt 24-Stundentage an, in denen PCR-Maschine und Pipettierdaumen nicht mehr stillstehen. Hat man überglücklich ein paar Kandidaten gefunden, bleibt dennoch eine Überprüfung der richtigen Integration mittels Southemblot-Analyse unerläßlich; die Stunde der Wahrheit. immer noch positive Klone werden dann in Blastocysten von pseudoschwangeren Mäusen injiziert. Diese unterscheiden sich von den manipulierten ES-Zellen im Gen für Fellfarbe.

Dadurch läßt sich an der chimären Nachkommenschaft der Anteil der mutierten ES-Zellen abschätzen. Doch erst wenn auch die Keimbahn getroffen ist und homologe Defektmutanten aus den Chimären herausgezüchtet sind, ist der Genetiker am gewünschten Ziel. Die Analyse des Phänotyps solcher "knock outs" kann beginnen. Diese 1987 von Mario Capecchi an der Universität Utah entwickelte Technik ist mittlerweile aus ihren Kinderschuhen herausgewachen und zur standardisierten Methode geworden, weltweit. Nicht zuletzt die Arbeitsgruppe des kürzlich verstorbenen Nobelpreisträgers Georges Köhler am Freiburger MPI für Immunbiologie hat daran ihren Anteil.

Doch was tun, wenn das auszuknockende Gen für die Embryonalentwicklung lebensnotwendig ist, also kein zu analysierender Phänotyp entsteht? Immunologen und Entwicklungsbiologen haben sich nicht mit dem Status quo zufriedengegeben. Anstelle des standardisierten Gene Targeting treten zunehmend gewebspezifische oder induzierte "Knock outs". In den 80er Jahren war der Molekularbiologe Brian Sauer der erste , der das Enzym CRE-Rekombinase des Bakteriophagen P 1 als ideales Werkzeug für genetische Manipulationen endeckte. CRE erkennt sogenannte lox-P-Sequenzen. Eine von solchen Erkennungsstrukturen eingerahmte DNA schneidet es mit hoher Effizienz aus dem DNA-Strang heraus, zurück bleibt eine einzelne lox-P-Stelle. Bringt man nun beispielsweise CRE unter T-zellspezifische Kontrolle und kreuzt eine derart transgene Maus mit einer zweiten, in der das auszuknockende Gen von lox-P flankiert wird, bekommt man Mäuse, in denen das betreffende Gen ausschließlich in T-Zellen fehlt.

Die mit der alten Technik letale Embryonalentwicklung verläuft normal und der Gendefekt läßt sich in T-Zellen ungestört studieren. Zur Zeit konstruieren Molekularbiologen mit diesem System weiter raffinierte genetische Mutanten: so können störende Selektionsmarker entfernt, Stop-Signale in Gene eingeführt und wieder herausgeschnitten und Gene - gleich einem Lichtschalter - einund ausgeschaltet werden.

Gene Targeting, das ist eine aufwendige, aber eine recht variantenreiche Technik der modernen Genetik, die Immunologen, Entwicklungsbiologen und nicht zuletzt Gentherapeuten einsetzen können. Wie sagte schon Mario Capecchi bei der Entwicklung dieser Methode: " Die Unsicherheit war groß, wie gut sich diese Technik wiederholen ließe. Wir alle aber hatten das Gefühl, daß damit eine Revolution in der biomedizinischen Wissenschaft verbunden sein würde."

Letzte Änderungen: 19.10.2004