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In der Organoid-Werkstatt

ORGANOIDE
von Henrik Müller, Laborjournal 05/2020


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(08.05.2020) Als Laborleiter am Tübinger Forschungsinstitut für Frauengesundheit baut André Koch eine Biobank für Tumor-Organoide auf. Sein Ziel unter anderem: Pharmazeutika in Zukunft direkt an Primärtumoren von Patienten testen. Laborjournal schaute ihm bei der Herstellung „seiner“ Organoide über die Schulter.

„Zu den richtigen Zellen zum richtigen Zeitpunkt die richtigen Wachstumsfaktoren geben!” – So fasst André Koch die 3D-Zellkultur zusammen.

Wir sitzen mit einem Morgenkaffee an einem quadratischen Tisch für zwei in seinem schnörkellosen Büro. Der Kaffeevollautomat ist seine erste und teuerste Anschaffung – zumindest in diesem Raum. Auf meine Frage, wie wir beginnen wollen, grinst er durch seinen getrimmten Vollbart und erklärt, sich von nun an das „Sie“ zu ersparen. Seine Augen fixieren mich freundlich. Er schaltet in den Erklärmodus.

Erst drei Jahre im Geschäft

In den letzten drei Jahren haben André Koch, seine drei TAs und eine Vielzahl von Studenten achtzig Organmodelle aus Gewebeproben von Tumorpatientinnen erstellt. Das Erstaunliche daran: Bis vor drei Jahren hatte Koch noch keine Ahnung von Organoiden.

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André Koch kontrolliert das Wachstum seiner Endometrium-Organoide. Maximal erreichen sie zwei Millimeter Durchmesser. Fotos (2): privat

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„Bis 2017 hatte ich mit Zellen nur in 2D gearbeitet. Auf Konferenzen hörte ich zwar von der Sensation ‚Organoide‘, gleichzeitig hieß es aber auch, sie bräuchten teure Spezialmedien, wüchsen schlecht und wären schwierig in der Handhabung.“

Nicht alle dieser Aussagen haben sich für Koch bewahrheitet. Außerdem witterte er eine seltene Chance:

„Als ich unsere Gewebebank überarbeitete, bemerkte ich, wie viel Karzinomgewebe wir in der Tübinger Frauenklinik zur Verfügung haben, tatsächlich aber nur wegfrieren.“

Also begann er, sich das Wachstum von Tumor-Organoiden ab 2018 mithilfe der einschlägigen Literatur selbst beizubringen. Sein Fokus liegt dabei auf Mammakarzinomen, also bösartigen Tumoren der menschlichen Brustdrüse, sowie auf Karzinomen des Endometriums, des epithelialen Drüsengewebes an der Innenwand des Uterus.

Es klappte sofort!

Kochs Antwort auf meine Vermutung, als Autodidakt sicher Monate bis zum ersten Organoid gebraucht zu haben, verblüfft mich dann:

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„Gar nicht. Es klappte sofort. Dank des intrinsischen Wunsches von Zellen, sich zu organisieren, ist 3D-Zellkultur kein Voodoo! Allerdings auch nichts, was über Nacht zu Ergebnissen führt. Aus Einzelzellen erhältst du binnen vierzehn Tagen schöne Organoide. Je nachdem, wie viele Zellen du benötigst, vergehen durchschnittlich aber vier Wochen zwischen Erhalt einer Gewebeprobe und deinem Nachweis-Assay. Erinnere dich einfach an grundlegende Regeln der 2D-Zellkultur und du hast eine ausreichende Basis.“

Eben das versuche ich in den zwanzig Sekunden, die mir bleiben, bis wir über den Gang in sein Zellkultur-Labor gewechselt sind.

Nichts geht dort über normale Zellkultur-Ausrüstung hinaus: Zwei Sicherheitswerkbänke brummen, das Statuslämpchen eines 37 °C-Schranks leuchtet, ein Thermo-Schüttler vibriert, ein paar Benchtop-Zentrifugen warten auf ihren Einsatz. Beinahe bin ich enttäuscht, dass sich Kochs S1-Labor nicht wirklich von anderen auf der Welt unterscheidet.

Ebenso wenig erkenne ich irgendetwas in der 24er-Multiwell-Platte, die Koch aus dem vollen 37 °C-Schrank nimmt. Zwar erahne ich weiße Pünktchen im roten Nährmedium, an Feinstrukturen ist aber nicht zu denken.

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Koch nickt: „Ohne Vaskularisierung wachsen Mammakarzinome infolge mangelnder Nährstoffversorgung nur bis auf 300 bis 400 Mikrometer Durchmesser. Endometrium-Organoide wachsen dank ihres hohlen Inneren bis zu einer Größe von ein bis zwei Millimetern.“

Ihre Winzigkeit macht es also unmöglich, Wachstumskinetiken mit bloßem Auge zu beurteilen.

„Gerade am Projektanfang ist das aber entscheidend. In der 2D-Zellkultur reicht es vielleicht, die Konfluenz des Zellrasens zu verfolgen. Da Organoide aber vereinzelt wachsen,...“.

... ist das Herzstück jedes Organoid-Labors ein vernünftiges Mikroskop. Kochs schnuckeliges Imaging-System eines weltbekannten Herstellers wissenschaftlicher Instrumente, Reagenzien und Verbrauchsmittel ist in einer Ecke des Zellkultur-Labors versteckt. Er bezeichnet es als das Organoid-Mikroskop schlechthin. Die obersten YouTube-Treffer der Suchbegriffe „organoid“ und „microscope“ überzeugen mich später von seiner Aussage.

Keine Organoide im Tohuwabohu

„Es muss vollautomatisiert sein, da du das Wachstum hunderter Organoide nicht täglich manuell nachvollziehen möchtest!“, erinnert er sich ein wenig gequält an seine Anfänge. „ Vor allem am Anfang möchtest du deine Zeit zum Sammeln praktischer Erfahrung verwenden, welche Einzelzellen oder Gewebeklümpchen im Fall deiner Organoide am besten wachsen.“

Also ist Organoid-Forschung doch nicht ohne kostspielige Anschaffungen möglich. Zumindest wenn 100.000 Euro für ein vollautomatisiertes Mikroskop eine unerschwingliche Hürde darstellen. Zur Beurteilung von Wachstumskinetiken reichen Zweifach- bis Zehnfach-Phasenkontrastobjektive aber vollkommen aus. In dieser Grundausstattung ist Kochs Favorit ohne Fluoreszenzkanäle bereits für 50.000 Euro zu haben.

Er platziert die warme und mit dem gestrigen Datum versehene Multiwell-Platte routiniert in die Haltevorrichtung des neben dem 37 °C-Schrank befindlichen Imaging-Systems, aktiviert eine Reihe von Schaltflächen der Mikroskop-Software – und auf dem Computerbildschirm erscheint ein Tohuwabohu unterschiedlichster Strukturen. Neben Stammzellen weist er mich auf die Vielfalt an Fibroblasten, Fettzellen, Erythrozyten sowie Reste der extrazellulären Matrix hin. Organoide finden sich in dem Durcheinander nicht.

Das stört ihn jedoch nicht.

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André Koch: „Behalte also im Hinterkopf, dass du nie mit letzter Sicherheit weißt, was deine Organoide stimuliert!“

„Die erste Frage ist, wie du dein Ausgangsgewebe, in unserem Fall Patienten-Biopsien, effektiv mit Kollagenase in fünfzig Mikrometer große Zell-Konglomerate aus bis zu zwanzig Zellen zerlegst. Glücklicherweise brauchst du dafür nur detaillierte Protokolle aus der Literatur für deinen Gewebetyp optimieren.“

Handhabung entscheidet

Die Herausforderungen in der Probenvorbereitung beschränken sich laut Koch auf Handhabungsfragen: „Vereinzelst du Gewebe im Thermo-Schüttler oder durch Auf- und Abpipettieren im Wasserbad? Mit welchem Spritzenvorsatzfilter trennst du Einzelzellen und Zellaggregate im Anschluss von Geweberesten ab? Wie vereinst du Zellsuspension und Matrigel unter der Sicherheitswerkbank im Nährmedium einer Multiwell-Platte, ohne Luftblasen im erstarrenden Hydrogel zu hinterlassen und ohne ein Dutzend Wachstumsfaktoren unterschiedlicher Konzentrationen durcheinander zu bringen?“

Für die Ausplattierung in Mikrotiterplatten empfiehlt Koch einen Richtwert von drei Vierteln Matrigel plus einem Viertel Zellsuspension. In 48er-Multiwell-Platten startet er pro Well mit 10.000 Zellen in 20-Mikroliter-Tropfen, in 24er-Platten mit 20.000 Zellen in 40-Mikroliter-Tropfen. Bei einem Volumenanteil von weniger als fünfzig Prozent Matrigel wachsen seine Endometrium- und Mammakarzinom-Organoide schlechter.

Weiterhin entpuppt sich die Oberflächenstruktur der Mikrotiterplatten als wichtig.

„Auf unbeschichteten Platten bleibt der Tropfen deiner Zellsuspension in Kugelform. Das macht das Wachstum von Organoiden weniger reproduzierbar. In dem Fall kannst du erst ein Bett aus zwanzig Mikrolitern Matrigel im Well erstarren lassen, bevor du die Zellsuspension hinzu pipettierst.“

Die Bedeutung des Zellkulturmediums führt mir Koch mit einer weiteren Mikrotiterplatte vor Augen. Die darin befindliche Organoid-Kultur hatte er nach mehrtägiger Inkubation am Vortag eins zu sechs verdünnt in frisches Nährmedium umgesetzt. Überbleibsel der Probenaufbereitung, die die Platte zuvor noch so sehr dominiert hatten, finde ich fast keine mehr.

Koch ist alles andere als erstaunt: „Unsere Zellkulturmedien sind auf bestimmte Stammzelltypen zugeschnitten. Alle anderen Zellarten wachsen nicht weiter und werden zusammen mit Geweberesten von Passage zu Passage ausgedünnt. Für Tumoroide stellt das übrigens ein elegantes Selektionskriterium dar. Denn manche Tumore wie Mamma- und Prostatakarzinome wachsen in 3D schlechter als nicht entartetes Kontrollgewebe, würden mit der Zeit also von Verunreinigungen normaler Stammzellen verdrängt. Problematisch ist das, falls keine etablierten Tumormarker existieren.“

Vorher an die Marker denken

Wie stelle ich also sicher, dass Organoide nur aus den gewünschten Zellarten bestehen?

„Indem du dir schon vor den ersten Wachstumsversuchen Gedanken über deine Nachweismethoden machst. Nicht ohne Grund wird viel Grundlagenforschung etwa an Kolonkarzinomen betrieben. Denn für sie gibt es klare Marker wie etwa Mutationen in APC-, KRAS- und TP53-Genen.“

Um die Bedeutung extrazellulärer Matrices klar zu machen, weist er mich auf eine Stelle hin, an welcher der zarte Hintergrundschleier des Matrigels verschwunden ist.

Nicht sehr nachtragend

„Dort haben Fibroblasten das Matrigel verdaut. In Kontakt mit dem Boden der Mikrotiterplatte haben sich Endometrium-Stammzellen daraufhin zu einem Zellhaufen differenziert, der als 2D-Teppich sein Dasein fristet.“

Matrigel ist für das native 3D-Wachstum von Organoiden also ein entscheidender Wohlfühlfaktor.

Koch empfiehlt: „Growth-factor-reduced Matrigel! Alle Hersteller produzieren Matrigel in Sarkoma-Zelllinien der Maus. Keiner von ihnen kann produktionsbedingte Reste muriner Wachstumsfaktoren ausschließen. Behalte also im Hinterkopf, dass du nie mit letzter Sicherheit weißt, was deine Organoide stimuliert!“

Dankbar für den Rat frage ich, wie häufig Ansätze gar nicht anwachsen?

„Kann passieren – aber nur, wenn etwas gründlich schiefgeht. Meine Organoide tragen es mir nur nach, wenn ich sie zu lange in verbrauchtem Medium belasse, sie zu weit verdünne oder in falschem Medium aufnehme. Ein paar Stunden nach Ausplattieren siehst du ihrer Zellmorphologie schon an, ob beispielsweise die Konzentration eines Wachstumsfaktors nicht stimmt.“

Denn jedes Organoid benötigt sein spezielles Nährmedium. Als Grundlage dient Koch meist Advanced Dulbecco‘s Modified Eagle‘s Medium (AdDMEM), zu dem er etwa zehn weitere Wachstumsfaktoren und -inhibitoren in der jeweils richtigen Konzentration pipettiert. Zu den Preisen erklärt er mir, dass eine 500-Milliliter-Flasche AdDMEM im Zehnerpack für zwanzig Euro pro Flasche zu haben ist. Die anfängliche Aufbereitung jeder Gewebeprobe kostet ihn nochmals sieben Euro, Matrigel pro Well etwa zwei Euro.

Die 3D-Zellkultur hat also zu Unrecht den Ruf, teuer zu sein?

Preis-Knaller

„Oh nein!“, weiß Koch. „Die meisten Zusatzstoffe wie Epidermal Growth Factor und Fibroblast Growth Factor werden günstig in Massen produziert. Es gibt aber drei extrem teure Faktoren – nämlich R-Spondin, Noggin und Wnt3a.“

Während R-Spondin und Noggin die Bone-Morphogenetic-Protein-(BMP)-Signalkaskaden inhibieren, die Stammzellen ansonsten zu Knochen- und Knorpelgewebe differenzieren lassen, aktiviert Wnt3a zentrale Wnt/β-Catenin-Signalkaskaden der Embryogenese.

Der Knall erfolgt in Form von Zahlen. „R-Spondin für zweihundert Milliliter Medium kostet fünfhundert Euro.“

Solche Preise sprengen den Finanzrahmen kleiner Labore. Doch selbst große, wie dasjenige des Organoid-Gurus Hans Clevers am Utrechter Hubrecht-Institut, sparen sich die Kosten.

„An dessen Stelle konditionieren sie günstiges Standardmedium, indem sie R-Spondin-sekretierende HEK293-Zelllinien in ihm inkubieren, es steril filtrieren und als 10-Prozent-Basis für ihre Organoidkultur einsetzen. Ich selbst habe von der American Type Culture Collection eine L-WRN-Fibroblastenlinie für satte 600 Euro gekauft, die alle drei Wachstumsfaktoren überexprimiert. Das rechnet sich schon nach dem ersten Monat. Einmal zehn Liter binnen drei Wochen hergestellt, und das Labor ist für monatelange Organoid-Generationen gerüstet.“

Wofür ich aber erstmal lernen muss, Organoide zu passagieren.

„Dafür nimmst du das Nährmedium ab, zerstößt alle Matrigeltropfen mit deiner Pipettenspitze und gibst TrypLE Express hinzu.“

Erst schütteln, dann ernten

TrypLE ist eine Serin-Protease mit Trypsin-ähnlicher Aktivität, die alle Zell-Zell-Kontakte sowie Matrigel verdaut. Mit den Verdauungsansätzen verfährt Koch nicht zimperlich, schließlich will er alle Organoide homogen zerkleinern und einer Nekrose in deren Inneren als Folge von Nährstoffmangel vorbeugen.

Während er die Suspension in einem Eppendorf-Gefäß für zehn Minuten bei 37 °C im Thermo-Schüttler inkubiert, beschreibt er mir Alternativen: „Du kannst den Verdauungsansatz auch durch 27G-Einwegkanülen oder gläserne Pasteurpipetten ziehen. Deren Scherkräfte reichen ebenfalls, um Gewebeklumpen zu zerkleinern. Je öfter, umso kleinere Organoid-Fragmente erhältst du.“

Nach einem Waschschritt mit PBS pelletiert er alle Zellen bei sanften 500 g für zehn Minuten, nimmt sie in frischem Nährmedium auf und plattiert ein Sechstel der Suspension in einer Multiwell-Platte aus.

Mit TrypLE ernte ich Organoide dann auch ganz zum Schluss?

„Nicht ganz“, berichtigt mich Koch, „denn dann musst du ja nur das Matrigel verdauen.“ Es klingt nach einem Erfahrungswert, als er fortfährt: „Ansonsten funktionieren deine Nachweis-Assays nicht – etwa weil die Sekundär-Antikörper deines Immunfluoreszenz- oder Western-Blot-Protokolls aus der Maus stammen und daher mit dem Matrigel kreuzreagieren. Oder weil das Expressionsmuster deiner humanen Organoide ansonsten überraschend viele murine Treffer enthält.“

Zu erntende Organoide inkubiert er deshalb für fünfzehn Minuten im Thermo-Schüttler in Anwesenheit von Dispase; diese zerkleinert nur das Fibronectin und Kollagen IV im Matrigel und löst so die Organoide heraus.

„Falls du Angst um die Oberflächenproteine deiner Organoide hast“, ergänzt er, „kannst du das Matrigel auch mit kommerzieller Organoid Harvesting Solution für sechzig Minuten bei 4 °C nicht-enzymatisch depolymerisieren. Ihre Zusammensetzung ist zwar ein patentiertes Geheimnis, aber du brauchst dir wenigstens keine Gedanken um die Aktivität von Proteasen machen.“

Zaghaft arbeitet Koch auch hier nicht. Selbst die Scherkräfte gelber 200-Mikroliter-Pipettenspitzen können seinen Organoiden nichts anhaben. Nach mehreren Waschschritten mit PBS schließt er ab: „Alles Weitere hängt von deinen Nachweismethoden ab. Wir entwässern unsere Organoide im Anschluss in einer Alkoholreihe und betten sie in Paraffin ein. Gewebeschnitte der Paraffinblöcke ziehen wir dann auf Objektträger auf und charakterisieren sie immunohistochemisch.“

Und falls ich Organoide zwar ernten, aber erst später verarbeiten möchte?

Als Antwort weist Koch auf einen -80 °C-Gefrierschrank und legt mir drei Aspekte ans Herz:

„Verwende ein kommerzielles Recovery Cell Culture Freezing Medium. Denn darin überleben mehr Zellen als in selbsthergestellten DMSO/FCS-Mischungen. Friere deine Organoide nur in Cell Freezing Containers ein, die Aliquots mit schonenden 1 °C pro Minute herunterkühlen. Und lagere sie in Flüssigstickstoff, um die bei -80 °C noch mögliche Probendynamik weiter einzuschränken.“

Erfahrung zählt

Kurz darauf sind wir zurück in Kochs Büro. Mein Kopf schwirrt von lauter Information, Koch ist noch immer voller Tatendrang. Aber das ist offensichtlich auch nötig. Denn binnen eines Arbeitstages reift natürlich niemand zum Organoid-Experten. Oder wie André Koch es zusammenfasst: „Die Grundlagen der Organoid-Forschung sind schnell erlernt. Die Herausforderung besteht aber darin, zu erkennen, was da gerade wächst. Das braucht Erfahrung.“

Es müssen zwei arbeitsreiche Jahre gewesen sein, seit Koch mit seinem Selbststudium von Organoiden begonnen hatte...

Last Changed: 08.05.2020

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