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Special Mikrobiologie

Die Unkultivierbaren
von Mario Rembold, Laborjournal 11/2018



Roboter unterstützen Joseph Strauss und sein Team an der Core Facility Bioactive Microbial Metabolites der Uni für Bodenkultur in Wien bei der Kultivierung von Pilzen. Foto: BiMM

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Es gibt noch immer Forscher, die bislang unkultivierte Mikroorganismen dauerhaft und möglichst als Reinkultur ins Labor holen. Mal geht es darum, die Biochemie der Mikroben und ihre Rolle in einem Ökosystem zu verstehen, mal steht die Suche nach neuen Wirkstoffen im Vordergrund. Auch Taxonomen brauchen kultivierte Mikroorganismen.

Moderne Mikrobiologen sequenzieren und machen viel Bioinformatik. Die Kultivierung der untersuchten Organismen scheint auf den ersten Blick also kaum mehr zeitgemäß. Schließlich gibt es als Standardwerkzeuge und Universalmodelle für mikrobiologische Experimente E. coli und, falls es mal eukaryotisch sein soll, die typischen Hefestämme.

Ganz so einfach ist die Welt der Mikrobiologen natürlich nicht, auch wenn Genomik und Metagenomik zum modernen Handwerk gehören. So wie bei Rudolf Amann vom Bremer Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie. Amann möchte wissen, von welchen Zuckern sich marine Flavobakterien ernähren. Deshalb sucht er in deren Genom nach charakteristischen Gen-Clustern. Darin kodiert ist letztlich, wie komplexe Polysaccharide in die Zelle aufgenommen und gespaltet werden. Mehr Details zu seiner Arbeit gibt’s ab Seite 36.

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Tatsächlich können die Bremer Meeresforscher in vielen Fällen aus den Sequenzdaten bakterieller Proben herauslesen, welches Polysaccharid eine bestimmte Mikrobe verstoffwechseln kann. „Anhand der Gensequenzen schließen wir auf die Zuckerzusammensetzung – also ob das Substrat Glukose, Mannose oder Rhamnose enthält“, nennt Amann typische Beispiele. Auch über Verknüpfungsmuster oder Sulfatgruppen im Zucker könne ein Bakteriengenom Aufschluss geben. Gleichzeitig schränkt Amann ein, dass solch eine Voraussage immer nur so gut sein könne, wie die verfügbaren Daten zu den bereits biochemisch getesteten Enzymen. Findet man in seinen Sequenzen ein neues Enzym, das einem bereits beschriebenen Protein zur Zuckerverwertung nur entfernt ähnelt, bleibt unklar, wie genau das Substrat der neu beschriebenen Variante tatsächlich aussieht.

„Die Metagenomik ist wunderbar, um Hypothesen zu generieren“, hebt Amann die Stärke der Sequenzanalytik hervor. Um diese Hypothesen zu testen, brauche es einen Methodenwechsel: Die Bakterien müssen lebend ins Labor, damit man überprüfen kann, welche Zucker sie wirklich verwerten und ob die Expression der entdeckten Gene durch den Zucker tatsächlich induziert wird. „Erstmal muss jemand die Bakterien aus den Proben isolieren. Dann brauche ich einen Glykobiologen, der mir komplexe Polysaccharidsubstrate in Reinform bereitstellt“, schildert Amann die ersten Schritte. Dabei können Meeresbewohner den Mikrobiologen das Leben schwer machen: „Marine Mikroorganismen teilen sich nicht wie E. coli im Zwanzig-Minuten-Takt. Sie brauchen dafür Stunden oder Tage; es gibt sogar Arten, die sich nur einmal im Monat oder Jahr teilen.“

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Hat man Glück mit seinem Bakterium, könne man in einer dreijährigen Doktorarbeit relativ weit kommen. „Es geht beim Testen der Hypothesen zunächst darum, die Genexpression zu induzieren und verschiedene Substrate auszuprobieren“, so Amann. „Anschließend muss man durch Proteomik zeigen, dass das Genprodukt wirklich gebildet wird. Danach folgen biochemische Untersuchungen und vielleicht auch die Kristallisation der Enzyme für Röntgenstrukturanalysen.“ Um das Kultivieren führt also kein Weg herum.

Auch in Saarbrücken stellen sich Forscher den Herausforderungen, neue Mikroorganismen im Labor zu halten. Dort ärgert sich Rolf Müller gelegentlich über die Dominanz der Sequenziertechniken in der Außenwahrnehmung. „Die klassische Mikrobiologie wird mittlerweile völlig vernachlässigt, da kommen Sie kaum noch an ein Funding, um neue Organismen zu isolieren und zu beschreiben“, bedauert Müller. „Ohne Kultivierung können Sie einen Mikroorganismus aber nicht wirklich kennenlernen.“

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Welcher Zucker marinen Flavobakterien mundet, verrät ihr Genom. Der Bremer Mikrobiologe Rudolf Amann sieht sich deshalb charakteristische Gen-Cluster an. Foto: MPIMM
Ein etabliertes Laborhaustier

Müller leitet die Forschungsgruppe „Mikrobielle Naturstoffe“ am Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung, einem Standort des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung. Als Pharmazeut interessieren ihn Mikroorganismen als Produzenten von Substanzen, die als mögliche Wirkstoffe in Frage kommen. Besonders die Myxobakterien haben es ihm angetan. Nun könnte man auch mithilfe der Metagenomik auf die Suche nach pharmakologisch wirksamen Molekülen gehen: Per Sequenzanalyse ermittelt man Gene, die interessante Proteine oder Peptide synthetisieren. Die kloniert man dann einfach in E. coli und bringt sie dort zur Expression. So greift man auf ein etabliertes Laborhaustier zurück und muss das Rad nicht neu erfinden, um einen exotischen Mikroorganismus zu kultivieren.

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Gelegentlich führe dieser Ansatz zu Erfolgen, doch für seine eigene Forschung reiche das nicht. „Wir suchen hier ja nicht nur nach der Lipase oder Esterase, die man einfach aus dem Metagenom klonieren und woanders reinstopfen kann“, bringt es Müller auf den Punkt. „Wir wollen auch Metabolite und Sekundärstoffe entdecken.“ Hinter manch kleinem Biomolekül stecken nämlich komplexe Stoffwechselwege. „Dazu gehört dann auch mal ein Biosynthese-Cluster im Genom, das hundert Kilobasen umfassen kann – wer kloniert Ihnen das mal eben in E. coli?“

Selbst wenn man Gene zur Synthese eines potenziellen Antibiotikums in E. coli einbringt: Die synthetisierte Substanz oder eine Zwischenstufe könnte ja auch toxisch sein für seinen Wirt. Vielleicht übersieht man ein regulatorisches Element im Genom, oder es gibt Vorstufen der Substanz, die E. coli gar nicht herstellen kann. „Wenn Sie das alles zusammenrechnen, wird schnell plausibel, dass wir allein mit metagenomischer DNA, die wir in einen heterologen Wirt stecken, wenig Chancen hätten“, resümiert Müller. Zwar arbeiten auch die Saarbrücker mit transgenen Bakterien, dieser Schritt folge jedoch meist erst, nachdem die Substanz entdeckt und charakterisiert ist. „Hier nutzen wir in der Regel näher verwandte Bakterien wie Myxococcus xanthus, der im Labor relativ schnell wächst.“

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Rolf Müller ist der Meinung: „Ohne Kultivierung können Sie einen Mikroorganismus nicht wirklich kennenlernen.“ Foto: HZI
Keiner hat es richtig versucht

Nun gelten viele Mikroorganismen als anspruchsvoll und lassen sich, so die gängige Meinung, nicht im Labor vermehren. Müller sieht das anders: „Dieses ‚Unkultivierbar’ ist doch Unsinn – im Prinzip heißt das nur: Keiner hat es richtig versucht! Sonst könnten sie ja auch in ihrem natürlichen Habitat nicht wachsen.“ Trotzdem sei es nicht immer leicht, eine neue Art in Kultur zu bringen. Alles beginnt damit, die Spezies zu isolieren und unterschiedliche Medien zu testen. „Bei Myxobakterien haben wir den enormen Vorteil, dass sie millimetergroße baumartige Strukturen und Fruchtkörper bilden, die wir im Stereomikroskop sehen können“, gibt Müller einen Einblick in die Arbeit seiner Gruppe. Denn Myxobakterien sind nur zeitweise als Einzeller unterwegs; unter bestimmten Bedingungen bewegen sie sich aufeinander zu und vereinigen sich zu größeren Strukturen. „Da verrät die Morphologie auch schon etwas über die taxonomische Zugehörigkeit.“

Jüngst haben die Saarbrücker zusammen mit Kollegen aus Teheran, Braunschweig und Gießen ein neues Myxobakterium beschrieben, das aus Bodenproben aus dem Iran isoliert wurde (Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 68(3): 721-9). Grundsätzlich ist Müller vielmehr an den scheinbar unspektakulären Biotopen interessiert. „Wir gehen eher nicht zum Geysir im Yellowstone, denn warum sollte ein Mikroorganismus, der bei pH 3 und 80 Grad Celsius lebt, auch noch einen Wirkstoff gegen Bakterien oder Pilze herstellen?“ Stattdessen bevorzugt er Böden und Sedimente mit hoher Artendiversität. Dort sei eine höhere Konkurrenz zu erwarten, und entsprechend finde man eher pharmazeutisch relevante Substanzen.

Neuer Bakterien-Schreck

Als vielversprechend sieht Müller die Cystobactamide, die sein Team 2014 und 2017 in Myxobakterien gefunden hat (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53(52): 14605-9 und Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 56(41): 12760-4). „Das ist eine völlig neue Substanzklasse mit einer Aktivität gegen gramnegative Bakterien.“ Mittlerweile habe man auch Daten, welche die Wirksamkeit der Cystobactamide im Tiermodell belegen, verrät Müller.

Mit Kultivierung beschäftigen sich auch Wissenschaftler der Universität für Bodenkultur (BOKU) Wien. Joseph Strauss leitet dort die Angewandte Genetik und Zellbiologie. Sein besonderes Interesse gilt den eukaryotischen Vertretern der Mikroorganismen – den Pilzen. „Wir erforschen epigenetische Regulationsmechanismen und möchten verstehen, welche Metabolite die Pilze unter welchen Bedingungen bilden“, umreißt Strauss seine Tätigkeit. Neben Fragen der Grundlagenforschung sucht er nach besonderen Substanzen, die in den Organismen unter epigenetischer Kontrolle stehen.

Mit dem BiMM (Bioactive Microbial Metabolites) hat die BOKU eine Core Facility eingerichtet, die ebenfalls von Strauss und seinem Team koodiniert wird. Hier gibt es Automatisierungsstraßen und robotergestütze Kultivierungssysteme. „Meines Wissens ist das in Österreich die einzige Einrichtung dieser Art, die solche Systeme öffentlich zugänglich macht“, freut sich Strauss, der dort auch Aufträge aus der Industrie bearbeitet.

Im Vergleich zu Bakterien seien Pilze häufig leichter im Labor zu halten, erklärt Strauss. „Die klassischen Schimmelpilze sind ganz einfach zu kultivieren, denn sie bilden Sporen und dürfen daher auch austrocknen.“ Fast alle Pilze hätten diese Dauerstadien, sodass sie auch unter ungünstigen Bedingungen erhalten bleiben oder wieder neu angesetzt werden können. „Es gibt aber obligat biotrophe Pilze, die zwingend einen pflanzlichen Partner brauchen“, schränkt Strauss ein. „Die gehen dann mit Pflanzen Symbiosen ein oder können als pathogene Pilze nicht ohne Wirt leben.“ In einem aktuellen Projekt möchten die Wiener solche Pilze zusammen mit Arabidopsis untersuchen. „Das wollen wir automatisieren und in den Hochdurchsatz bekommen.“

Im Mai hatte das Team über einen aus der Donau isolierten Pilz berichtet (Nova Hedwigia 107(3-4): 487-500). „Metapochonia lutea bevorzugt extrem nasse Bedingungen, das ist selten für einen Pilz“, so Strauss. Aktuell freut sich der Forscher außerdem über drei Substanzen. Die hat das BiMM-Team beim Screening tausender Kombinationen epigenetisch behandelter Pilzproben und Bakterien entdeckt: Ein Enzym, das Kunststoff zersetzt, ein Antibiotikum gegen gramnegative Bakterien und einen Regulator des Zellzyklus. „Der könnte als Therapeutikum für die Onkologie in Frage kommen“, hofft Strauss. Einzelheiten könne er hierzu nicht verraten, weil derzeit noch das Verfahren zur Patentierung laufe.

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Manche Pilze lassen sich schwer, andere einfach kultivieren... Foto: BiMM
Bitte alles auf Risiko

Auch für Strauss beginnt die Suche nach interessanten Substanzen mit der Kultivierung und dem Austüfteln der richtigen Wachstumsbedingungen. Häufig sei eine Ko-Kultivierung mit anderen Organismen nötig. Und weil diese Schritte mühsam sind, halten sich Projektpartner in dieser Phase lieber noch im Hintergrund. „Die pharmazeutische Industrie steigt erst mit ein, wenn wir etwas gefunden haben und es schon einen großen Datensatz gibt“, bedauert Strauss. „Da wünsche ich mir mehr Visionen und Risikobereitschaft; die Industrie sollte die Förderung nicht nur der öffentlichen Hand überlassen.“

Eine wichtige Anlaufstelle für Mikrobiologen unseres Verbreitungsgebiets ist das Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen – oder kurz DSMZ. Die DSMZ bewahrt Mikroorganismen auf und archiviert nach eigenen Angaben derzeit 27.000 unterschiedliche Bakterien- und 6.000 Pilzstämme. Hinzu kommen hunderte eukaryotische Zelllinien, Viren und DNA-Proben. Eine Aufgabe der Sammlung besteht darin, validierte taxonomische Arten von Mikroorganismen für die Forschung verfügbar zu halten.

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... Joseph Strauss und sein Team nehmen es mit allen auf. Foto: BiMM

„Wir sind eine von weltweit etwa 600 anerkannten öffentlichen Sammlungen, die hierfür die Kapazitäten und das Know-how haben“, erklärt der wissenschaftliche Direktor der DSMZ, Jörg Overmann. Damit ein Mikroorganismus als Spezies anerkannt ist, muss er unter anderem in zwei dieser weltweiten Sammlungen hinterlegt sein – und zwar als Reinkultur. Natürlich können Forscher auch auf eigene Faust neue Arten entdecken und beschreiben, diese gelten jedoch nicht als validiert und erhalten keinen international anerkannten Doppelnamen im Stil von Carl von Linné.

Doch auch ohne Validierung können Forscher mit den Mikroben arbeiten. Dafür erhält eine neu entdeckte Art gewissermaßen „provisorisch“ den Zusatz „Candidatus“ im Namen. Das gilt auch für Organismen, die gar nicht in Reinkultur wachsen, weil sie etwa auf einen Symbionten angewiesen sind; sie können folglich nur den Status eines Candidatus erlangen.

Keine neue Art ohne Reinkultur

Overmann und seine Kollegen haben sich mit dieser Thematik beschäftigt und hierzu im Sommer einen Artikel veröffentlicht (Syst. Appl. Microbiol., doi: 10.1016/j.syapm.2018.08.009). Darin präsentieren sie zum einen eine Bestandsaufnahme zum taxonomischen Umgang mit neu entdeckten Mikroorganismen, zum anderen nennen sie Bedingungen, die erfüllt sein sollten, falls man den International Code of Nomenclature of Prokaryotes (ICNP) erweitert. Dadurch könnte man den taxonomischen Umgang mit Mikroben erleichtern, die lediglich über Sequenzanalysen charakterisiert worden sind.

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DSMZ-Direktor Jörg Overmann ist für eine Zwischenlösung in der mikrobiellen Taxonomie. Foto: DSMZ

„Derzeit unterscheiden wir 118 Bakterienphyla. 85 dieser Phyla enthalten ausschließlich Arten, die bislang nicht kultiviert worden sind“, gibt Overmann einen Überblick zur Bakterientaxonomie und hält fest: „Ganze Phyla bestehen also nur aus Sequenztypen.“ Auch von den anderen Bakteriengruppen wachsen die meisten Vertreter bislang in keinem Labor. In ihrem Artikel berichten die Autoren zwar über rund 14.000 Bakterien und Archaeen, die jeweils als eigene Art validiert sind, doch sie schätzen, dass dieser Anteil weit weniger als ein Prozent aller bakteriellen Spezies ausmacht. Den 14.000 validierten Arten stehen rund sechs Millionen Sequenzen ribosomaler RNA gegenüber und 250.000 sogenannte Operational Taxonomic Units (OTUs), die lediglich anhand ihrer Genome unterschieden werden.

Aufwändig und mühsam

Derzeit, so schreiben die Autoren im Paper, würden pro Jahr mehr vollständige bakterielle Sequenzen hinterlegt als neue Arten validiert. Von der Möglichkeit, einen Candidatus zu benennen, macht die Mikrobiologen-Community nur sehr zurückhaltend Gebrauch. Lediglich an die 400 Candidatus-Arten waren bis 2015 registriert. „Vermutlich, weil auch schon dieser Prozess recht aufwändig und mühsam sein kann“, so Overmann. „Zum Beispiel müssen Sie Ihren Organismus über In-situ-Hybridisierung nachweisen. Das kann kompliziert werden, wenn Sie ihn nicht isolieren oder vermehren können und er nur in geringen Mengen vorliegt.“

Stellt die Reinkultur als Voraussetzung für den Eintrag als Art vielleicht eine zu große Hürde dar? „Die Rate der Neubeschreibungen liegt relativ konstant bei nur 600 bis 800 pro Jahr“, räumt Overmann ein. Es sei demnach utopisch, dass man in absehbarer Zeit auch nur annähernd alle Bakterienarten in öffentlichen Sammlungen kultiviert bekomme. „Die Frage ist nur, welche Schlussfolgerung wir daraus ziehen“, entgegnet Overmann den Kritikern der etablierten Nomenklatur-Regularien. Das bisherige System komplett über Bord zu werfen, hält er für den falschen Weg.

Der eigentliche Sinn und Zweck

Doch ist es bei Bakterien und Archaeen nicht letztlich immer das Genom, das den Unterschied zwischen zwei Arten ausmacht? „In der Tat hilft uns die Morphologie in der Regel nicht weiter, aber das bedeutet nicht, dass wir phänotypische Eigenschaften und die Funktion der Gene einfach außen vor lassen können“, meint Overmann und erinnert an den eigentlichen Sinn und Zweck eines taxonomischen Systems: „Die Einteilung sollte am Ende die Evolution reflektieren und erklären können, wie die Diversität der Arten entstanden ist.“ Einige Sequenzunterschiede haben etwa kaum eine evolutive Bedeutung, während andere Gene sehr wichtig für die Anpassung einer Art an ihre ökologische Nische sind. Und weil die Funktionen der meisten Sequenzen unbekannt sind, lässt sich aus den metagenomischen Daten nicht viel ablesen über die ökologisch und biochemisch relevanten Unterschiede zwischen den Mikroorganismen. „Die oft nur zwanzig bis dreißig Prozent im Genom, die wir verstehen, umfassen vorwiegend Housekeeping-Gene – und die sagen gar nichts aus über spezifische Funktionen.“ Somit kann der Bioinformatiker aus dem Metagenom lediglich mehr oder weniger wahrscheinliche Stammbäume errechnen.

Ließe man solch einen Sequenzdaten-Stammbaum als alleiniges Kriterium zur Anerkennung einer neuen Art gelten, hätte man wohl nicht viel gewonnen. „Dann würde einfach nur das Briefmarkensammeln losgehen“, ist sich Overmann sicher. Um der zunehmenden Bedeutung der Metagenomik Rechnung zu tragen, kann sich der DSMZ-Direktor eine Zwischenlösung vorstellen: „Wenn ich einen Mindestanteil der funktionellen Gene ermittelt habe, und das sollten mehr als dreißig Prozent des Genoms sein, und wenn auch zusätzliche ökologische Daten auf eine eigene taxonomische Einheit hindeuten – dann sollte ich einen binären Namen nach gängigem System vergeben können.“ Der Name müsste dennoch einen Zusatz tragen, der klarstellt, dass die taxonomische Einordnung auf kulturunabhängigen Daten basiert. Für eine spätere Validierung wäre der Name schon reserviert (das bisherige „Candidatus“-System legt keine Namen verbindlich fest). Die strengen Kriterien für eine validierte Art sollten laut Overmann bleiben.

Bleibt festzuhalten, dass Genomik und Sequenziermethoden aus der modernen Mikrobiologie nicht mehr wegzudenken sind. Das Gleiche gilt auch für die Kultivierung der „Unkultivierbaren“, denn die alteingesessenen „Labor-Haustiere“ können uns nicht alle Fragen beantworten. Schließlich ist und bleibt ja auch der lebende Organismus das eigentlich Interessante in der Biologie.

Last Changed: 08.11.2018

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