(13.06.2022) Seit Anfang der neunziger Jahre entwickelten Molekularbiologen eine ganze Fülle isothermaler Amplifikations-Verfahren mit sehr ausgekügelten Reaktionsmechanismen. Die meisten Protokolle sind aber dennoch äußerst simpel.
Die Vervielfältigung von DNA oder RNA mit isothermalen Amplifikations-Techniken rückte insbesondere durch neue Testverfahren für den Nachweis von SARS-CoV-2 verstärkt in den Fokus von Forschungs- und Diagnostiklaboren. Bis dahin führten sie ein ziemliches Mauerblümchen-Dasein im Schatten der übermächtigen PCR, obwohl sie praktisch zur gleichen Zeit wie die PCR entwickelt wurden. Genau genommen fand die erste isothermale In-vitro-Amplifikation einer Nukleinsäure sogar schon lange vor der PCR statt. Der RNA-Pionier Sol Spiegelman von der University of Illinois kopierte bereits 1965 die RNA des Phagen Qbeta bei konstanten 35 Grad Celsius mit der aus E. coli isolierten RNA-abhängigen RNA-Polymerase von Qbeta (PNAS 54(3): 919-27).
Es dauerte dann aber noch einige Jahrzehnte bis Anfang der neunziger Jahre die ersten praktikablen isothermalen Amplifikations-Methoden auftauchten. Obwohl diese teils sehr unterschiedliche und auf den ersten Blick auch komplizierte Techniken für die Amplifikation nutzen, fußen alle Protokolle auf demselben Grundprinzip: Die doppelsträngige Nukleinsäure-Vorlage wird während der Amplifikations-Phase nicht durch eine hohe Temperatur getrennt, um Primern den Weg für die Hybridisierung an die Zielsequenzen freizumachen. Stattdessen verwenden die Methoden-Entwickler dazu verschiedene molekularbiologische Tricks, die sie von der natürlichen Replikations-Maschinerie abgekupfert haben.
Im Gegensatz zur PCR reicht für die isothermale Amplifikation von Nukleinsäuren zur Not auch ein Sous-Vide-Kochtopf mit einstellbarer Temperatur. Hier wurde das Wasser für den Nachweis des SARS-CoV-2-Virus mit einem LAMP-Assay auf 65 Grad Celsius aufgeheizt. Foto: Gruppe Krumbholz
Zu diesen zählen zum Beispiel mit T7-Promotoren verknüpfte Primer, die als Initiationsstellen für die T7-RNA-Polymerase dienen. Bei der sogenannten Self-Sustained Sequence Replication (3SR) wird das RNA-Template mit den T7-Primern zunächst revers transkribiert, um eine doppelsträngige cDNA mit einem T7-Promoter zu erhalten. Die T7-RNA-Polymerase nutzt die cDNA als Vorlage und synthetisiert mit ihrer Hilfe RNA-Transkripte mit T7-Promotoren, die erneut revers transkribiert werden. Durch diesen bei einer Temperatur von etwa 40 Grad Celsius ablaufenden Zyklus vermehrt sich die dsDNA exponentiell, bis die eingesetzten Nukleotide und Oligos verbraucht sind oder die Enzyme ihre Aktivität einbüßen.
An der akademischen Forschung ist die Anfang der neunziger Jahre entwickelte 3SR-Technik aber mehr oder weniger spurlos vorübergegangen und kaum eine Gruppe dürfte sie gegenwärtig anwenden. In der Diagnostik sieht das etwas anders aus. Die von Forschern des französischen Diagnostikspezialisten bioMérieux entwickelte NASBA-Methode (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) funktioniert ganz ähnlich wie 3SR und wird tagtäglich weltweit in Diagnostiklaboren eingesetzt, um zum Beispiel RNA-Viren wie HIV nachzuweisen.
In der Trickkiste der isothermalen Amplifikation finden sich aber auch Nicking-Enzyme, Strang-verdrängende Polymerasen, Strang-Rückfaltungen, Helikasen oder in den Strang eindringende Rekombinasen. Der Urvater der durch Nicking-Enzyme vermittelten isothermalen Amplifikation ist die Strand Displacement Amplification (SDA), die eine Gruppe der US-Firma Becton Dickinson 1992 erfand – zu einer Zeit also, als man noch keine Nicking-Enzyme von der Stange kaufen konnte. Aber es gab schon damals eine reiche Auswahl an Restriktionsenzymen, die man mit einem kleinen Kniff in Nicking-Enzyme umfunktionieren konnte.
Das Team denaturierte hierzu zunächst die doppelsträngige Ziel-DNA und gab einen Ziel-spezifischen Primer hinzu, der an seinem 5‘-Ende die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym HincII trug. Anschließend verlängerten die US-Forscher den komplementären Strang des Primers mit einer Strang-verdrängenden Polymerase sowie dNTPs, die ein modifiziertes Adenin in das HincII-Motiv des Primer-Anhängsels einführten. Verdauten sie den hierdurch erzeugten Doppelstrang mit HincII, konnte das Restriktionsenzym nur den nicht-modifizierten Strang schneiden, es verhielt sich also wie ein Nicking-Enzym. Eine Strang-verdrängende Polymerase verlängerte hierauf den Primer an der Bruchstelle in 3‘-Richtung und synthetisierte einen neuen Strang mit intaktem Erkennungsmotiv für HincII, an das erneut ein Primer binden konnte.
Inzwischen ist der etwas mühsame Umweg über die ausgetricksten Restriktionsenzyme nicht mehr nötig, der Experimentator besorgt sich für die SDA einfach ein passendes Nicking-Enzym sowie Primer mit dem entsprechenden Erkennungsmotiv. Er hat jedoch, wie bei den meisten anderen isothermalen Amplifikationsverfahren auch, die Qual der Wahl zwischen zahlreichen Varianten, die findige Forscher in den vergangenen Jahren entwickelten. So kann man zum Beispiel bei der iSDA (isothermal Strand Displacement Amplification) auf die initiale Hitzedenaturierung verzichten. Stattdessen nutzt man das „Atmen“ der DNA, bei dem sich einzelne Basenpaare kurzzeitig öffnen, um den Primer mit dem Nicking-Enzym-Motiv auf dem anvisierten Sequenzabschnitt zu platzieren. Der Rest läuft dann ähnlich ab wie bei der klassischen SDA.
Schon bald nach dem Auftauchen des CRISPR-Cas-Systems modelten Molekularbiologen dieses auch für die SDA um. Bei der CRISPR-Cas9-triggered Nicking Endonuclease-mediated Strand Displacement Amplification oder kurz CRISDA knabbert die von einer guideRNA zur Zielsequenz gelenkte Endonuklease Cas9 die nötige Lücke für das Primer-Annealing in den Doppelstrang. Da sich der CRISPR-Cas9-Komplex aber mit Vehemenz an die Zielsequenz klammert und nicht mehr von dieser ablässt, muss man ihn so positionieren, dass er die Bindung des Primers an das Template nicht behindert.
Zu den isothermalen Amplifikations-Methoden, die Strang-Rückfaltungen für die schnelle Vervielfältigung von Nukleinsäuren ausnutzen, gehört insbesondere die während der Corona-Pandemie ins Rampenlicht gerückte Loop-mediated AMPlification (LAMP). Schaut man sich die komplett abgedrehte schematische Darstellung der LAMP im ursprünglichen Paper an, wundert man sich zunächst, dass dieses wilde Protokoll mit einem ganzen Zoo verschiedener Primer und Zwischenprodukte tatsächlich zu einer amplifizierten DNA-Sequenz führt (Nucl. Acids Res. 28(12): E63). Bei genauer Betrachtung ist das äußerst phantasievolle, von Forschern der japanischen Biotech-Firma Eiken Chemical ausgedachte LAMP-Prinzip aber nicht mehr ganz so kompliziert. Der entscheidende Trick ist die in der ersten Stufe der LAMP mithilfe eines inneren Primers sowie eines Loop-Primers hergestellte hantelförmige Zwischenstufe mit einem verlängerbaren 3‘-Ende auf der einen Seite der Hantel und dem 5‘-Ende auf der anderen. Die einzelsträngige Hantel-DNA wird mit einem äußeren Primer sowie einer Strang-verdrängenden Polymerase von dem Template gelöst und kann während der Amplifikations-Phase zwei unterschiedliche Wege einschlagen: Entweder verlängert eine Strang-verdrängende Polymerase das 3‘-Ende oder die komplette Hantel-DNA wird mit einem inneren Primer kopiert. Im ersten Fall entsteht eine doppelsträngige DNA (dsDNA) mit einer Haarnadelschleife an einem Ende, im zweiten eine lineare dsDNA, die aufgrund der integrierten Loop-Primer erneut eine hantelförmige Struktur bildet.
Auch die nach der 3‘-Verlängerung entstandene dsDNA mit Haarnadelschleife faltet sich zurück und formt hierdurch eine hantelförmige Struktur mit jetzt zwei Schleifen an einem Ende. Die dsDNA mit Hairpin wird zudem auch kopiert, wenn ein innerer Primer bindet, wodurch das ursprüngliche hantelförmige Template regeneriert wird. Bei diesem Spiel aus 3‘-Verlängerung, erneuter Bildung von Hairpins durch Rückfaltung sowie Kopieren der DNA mithilfe von inneren Primern bildet sich schließlich ein riesiges Gewurstel aus Concatameren der Zielsequenz, das mit entsprechenden Verfahren detektiert wird.
Wie die PCR lässt sich auch die LAMP sehr einfach mit einer reversen Transkription verknüpfen (RT-LAMP), um neben DNA auch RNA nachweisen zu können. Am elegantesten funktioniert dies mit Polymerasen, die zusätzlich eine Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweisen wie die Enzyme Bst 3.0 oder OmniAmp.
Im Laufe der Pandemie entwickelten Forscher gut drei dutzend LAMP-Protokolle für den Nachweis von SARS-CoV-2 und optimierten bei diesen insbesondere die Detektion der amplifizierten RNA. Klar, dass dabei auch das CRISPR-Cas-System nicht fehlen durfte. So wird die Virus-RNA bei der sogenannten DETECTR-Methode nach der Amplifikation durch LAMP mithilfe des Cas12-Enzyms aufgespürt.
Von den vielen neuen LAMP-Varianten schafften bisher aber nur wenige den Sprung aus den Versuchslaboren in die SARS-CoV-2-Testzentren. Ausnahmen sind der in Großbritannien während der „Operation Moonshot“ in größerem Umfang eingesetzte RT-LAMP-Assay der britischen Firma OptiGene sowie der seit Mai 2022 in Neuseeland probeweise an Flughäfen verwendete LAMP-Kit der US-Firma Lucira. Letzterer soll innerhalb von dreißig Minuten ein Ergebnis liefern, das so zuverlässig ist wie ein qPCR-Test.
Ähnlich ausgeklügelt wie die LAMP ist auch die Recombinase Polymerase Amplification (RPA), bei der die Rekombinase T4 uvsX die Bindestellen für die Primer auf dem Template freischaufelt. Dazu wird sie mithilfe des Beladungsfaktors T4 UvsY auf den Primer gehievt und von diesem zur homologen Zielsequenz geführt. Dort angekommen öffnet die Rekombinase den Doppelstrang. Der Primer bindet hierauf an den homologen Strang, während der andere Strang einen D-Loop ausbildet, den Einzelstrang-bindende Proteine stabilisieren. Sobald der Primer an die Zielsequenz angedockt hat, zerfällt der Rekombinase-Primer-Komplex und eine strangverdrängende Polymerase verlängert das 3‘-Ende des Primers. Die beiden Stränge des Templates werden hierdurch kopiert und immer wieder in den exponentiellen Amplifikations-Zyklus eingeschleust.
Im echten Leben ist der RPA-Mechanismus aber etwas komplizierter. Die Rekombinase uvsX ist für die Bindung an die Oligos auf ATP angewiesen, das während des Auseinanderfallens des uvsX-Primer-Komplexes zu ADP hydrolysiert und von einem Kreatin-Kinase/Phosphokreatin-System wieder regeneriert wird. Um das Ganze auf die Spitze zu treiben, muss man die Reaktion auch noch ein bisschen mit dem Chromatographiesäulen-Harz Carbowax20M pampern, um das Gleichgewicht in Richtung der uvsX-Beladung zu verschieben. Die RPA im Labor selbst auf die Beine zu stellen, dürfte aufgrund der verschiedenen Komponenten, die während der Amplifikation nahtlos ineinandergreifen müssen, nicht ganz einfach sein. Freuen kann sich darüber die englische Firma TwistDX, die das RPA-Verfahren entwickelt hat und entsprechende Kits verkauft.
Die unterschiedlichen Techniken und Varianten der isothermalen Amplifikation bieten sich aber dennoch für experimentierfreudige Gruppen an, die dem Thermocycler auch mal eine Pause gönnen wollen. Mit Ausnahme der RPA benötigt man für die Verfahren meist nicht viel mehr als ein paar Enzyme sowie Reagenzien, die man bei den einschlägigen Herstellern kaufen kann, und ein gut durchdachtes Protokoll.
Isothermale Amplifikationsverfahren im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 6/2022, Stand: Mai 2022, alle Angaben ohne Gewähr)