(10.03.2022) Bei Nadel-basierten Mikroplatten-Waschern bleibt immer ein kleines Restvolumen in den Wells zurück. Neuartige Wascher, die die Platten trockenschleudern, entfernen dagegen auch noch das letzte Tröpfchen.
Die Waschmaschine regelmäßig mit verdreckter Wäsche zu füllen und letztere anschließend zum Trocknen auf einen Wäscheständer zu hängen, zählt sicher nicht zu den beliebtesten Aufgaben im Haushalt. Im Labor sieht es nicht viel anders aus. Niemand ist scharf darauf, gebrauchte Laborutensilien von Hand zu spülen, und jeder ist froh, wenn sich die fleißigen Mitarbeiter in der Spülküche um die Reinigung kümmern.
In biowissenschaftlichen Laboren gehört Waschen und Spülen aber schon im Verlauf vieler Protokolle zur alltäglichen Routine – etwa bei den zahllosen kolorimetrischen oder Fluoreszenz-basierten Assays, die zumeist in Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Sind nur wenige Platten abzuarbeiten, lassen sich die vielen Waschschritte vielleicht noch mit der Mehrkanalpipette von Hand bewältigen. In den meisten Fällen ist es aber wesentlich effektiver und sinnvoller, die Waschdurchgänge einem Mikroplatten-Wascher zu überlassen, der den Job in wenigen Sekunden erledigt. Dazu sind die Geräte mit allem ausgestattet, was für eine gründliche Reinigung nötig ist: einer Pumpe, die die Waschlösungen zu einem Waschkopf befördert, einem Vakuumsystem, das nicht mehr gebrauchte Flüssigkeiten aus den Wells absaugt, sowie einer flexiblen Steuereinheit, die eine Fülle von Waschprozeduren ausführen und kontrollieren kann.
Nach dem selben Prinzip wie diese mit Muskelkraft betriebene Wäscheschleuder funktionieren auch zentrifugale Mikroplatten-Wascher. Foto: The Green Lever
Die Waschköpfe sind in den meisten Modellen austauschbar, um sie an verschiedene Plattenformate anpassen zu können. Waschköpfe, die mit acht oder zwölf Nadeln beziehungsweise Nadelpaaren bestückt sind, passen zu 96-Well-Platten, für 384-Well-Platten ist meist ein 1x16-Waschkopf vorgesehen. Einige Hersteller favorisieren aber auch Waschköpfe mit 96 oder 384 Nadeln, die die entsprechenden Platten in einem Rutsch waschen – oder bei der Kombination aus Waschkopf mit 96 Nadeln und 384-Well-Platte in vier Durchgängen abarbeiten.
Mikroplatten-Wascher sollten die Spülvorgänge aber nicht nur schnell erledigen, sondern auch gründlich, ohne dabei das Kind beziehungsweise den Inhalt in den Näpfchen gleich mit dem Bade auszuschütten. Insbesondere adhärent auf den Well-Böden wachsende Zellen können ziemlich verschnupft reagieren, wenn sie während des Medienwechsels durch einen direkt auf den Boden gerichteten harten Strahl aus der Dispensiernadel „weggekärchert“ werden. Bei Waschköpfen für Zellkulturplatten läuft das Ende der Nadeln deshalb meist etwas schräg aus, damit die zugegebene Flüssigkeit sanft an der Wandungen der Wells entlang Richtung Boden fließen kann.
Zusätzlichen Schutz bieten Waschprogramme für empfindliche Proben, bei denen die Flussraten reduziert sind und die Nadeln langsamer als üblich in die Wells eintauchen. Meist kann man auch die horizontale und vertikale Position der Nadeln in den Wells auf den jeweiligen Zweck ausrichten. Selbst die zeitliche Abfolge von Aspirieren und Dispensieren ist bei manchen Instrumenten variabel. Bei den üblichen Waschmodi erfolgen Absaugen und Spülen nacheinander. Finden beide Prozesse jedoch gleichzeitig statt, werden die Wells durch die entstehenden Turbulenzen besonders gründlich gespült.
Ein wichtiges Qualitätskriterium von Mikroplatten-Waschern ist die Restflüssigkeit, die nach dem Waschprozess in den Wells zurückbleibt. Damit nachfolgende Reaktionen oder Assays nicht gestört oder Ergebnisse verfälscht werden, sollte diese so klein wie möglich sein. Winzige Tropfen vom Boden eines Wells mit Edelstahlnadeln oder Spitzen abzuheben, ist aber ziemlich schwierig. Spätestens ab einem Restvolumen von etwa einem Mikroliter pro Well ist der Kampf gegen die physikalischen Gesetze kleiner Tröpfchen aussichtslos. Entsprechend findet sich in den Geräte-Spezifikationen Nadel-basierter Platten-Wascher meist ein recht einheitlicher Wert für das Restvolumen von zwei Mikrolitern.
Zwei deutsche Newcomer unter den Herstellern für Mikroplatten-Waschern gaben sich mit dieser Zahl aber nicht zufrieden – und offensichtlich ließen sich die Ingenieure auf der Suche nach einer Alternative zu Nadeln und Pipettenspitzen von Wäscheschleudern inspirieren. Beide Firmen nutzen das Prinzip einer rotierenden Wäschetrommel, um die Flüssigkeiten mithilfe der Zentrifugalkraft aus den Wells herauszuschleudern. Dazu wird die 96-, 384-, oder 1.536-Well-Platte zunächst auf die Aufnahme eines horizontalen Ladeschachts gelegt. Der Wascher zieht die Platte in den Schacht ein, gleichzeitig füllt der Dispensierkopf die Wells kontaktlos Reihe für Reihe mit der gewünschten Waschflüssigkeit. Danach schließt sich der Deckel des Schachts und die befüllte Platte wird in einen waagrecht angeordneten Zylinder weitertransportiert, der an eine Wäschetrommel im Kleinformat erinnert. Um zu verhindern, dass die Flüssigkeit in den Wells unkontrolliert überschwappt, setzt sich die Trommel schlagartig mit hoher Drehzahl in Bewegung und beschleunigt die Mikrotiterplatten auf bis zu 600 g. Die Waschflüssigkeit wird hierdurch aus den Wells herausgeschleudert und landet auf der hydrophoben Oberfläche der Trommelinnenseite. Dort wird sie in einem Kanalsystem gesammelt und zu einem Abfallbehälter geleitet. Anschließend stoppt die Trommel mit waagrecht positionierten Wells und entlässt die Platte wieder in den Schacht. Ist ein erneuter Waschdurchgang vorgesehen, werden die Wells während des Transports im Schacht wieder befüllt und sind danach bereit für einen weiteren Schleudergang.
Das in den Näpfchen zurückbleibende Restvolumen ist deutlich geringer als bei Nadel-basierten Waschern und mit weniger als 0,1 Mikrolitern kaum der Rede wert. Zudem funktioniert die Schleudertechnik auch mit 1.536-Well-Platten tadellos, an denen die meisten konventionellen Platten-Wascher scheitern. Zentrifugal-Wascher bieten sich insbesondere für die Herstellung von NGS-Bibliotheken mit Bead-basierten Techniken im Hochdurchsatz an. Damit die magnetischen Beads während der Waschschritte nicht verloren gehen, werden die Platten einfach auf passenden magnetischen Einsätzen platziert.
Biowissenschaftler verwenden Platten-Wascher meist für ELISAs, zellbasierte Assays oder die NGS-Probenvorbereitung. Einen Open-Source-Wascher für einen etwas ausgefalleneren Zweck konstruierte hingegen Timothy Fuqua während seiner Doktorarbeit in Justin Crockers Gruppe am Europäischen Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) in Heidelberg. Fuqua untersuchte in seiner Arbeit die Regulation der Genexpression während der Entwicklung von Drosophila-Embryos durch Enhancer-Sequenzen. Enhancer sind entfernt vom Promotor gelegene regulatorische DNA-Abschnitte, die mit Transkriptionsfaktoren an der Startstelle der Transkription interagieren und hierdurch die Expression eines Gens modulieren. So steuert zum Beispiel der Enhancer E3 die Expression des Drosophila-Gens shavenbaby (svb), das als Master-Regulator unter anderem die Ausbildung haarartiger Strukturen, sogenannte Trichomen, auf den einzelnen Segmenten des Drosophila-Embryos kontrolliert.
Timothy Fuqua entwickelte einen raffinierten Platten-Wascher für die Fixierung und Färbung von Drosophila-Embryos. Foto: Justin Crocker
Um mehr über die Funktionsweise des E3-Enhancers herauszufinden, stellte Fuqua hunderte E3-Mutanten her, fusionierte diese jeweils mit einem lacZ-Gen und transformierte Fliegen mit den Konstrukten. Versetzte er Embryos der transgenen Fliegen mit dem Farbstoff X-Gal, katalysierte die beta-Galactosidase die Umsetzung von X-Gal zu einem blauen Reaktionsprodukt. An der blauen Farbe konnte Fuqua schließlich erkennen, wo E3 in den Embryos aktiv ist. Der Wahl-Heidelberger musste für den Screening-Prozess jedoch unzählige Fliegen-Embryos präparieren, fixieren, waschen, färben und danach mit einem Mikroskop auswerten. Um dem Ganzen Herr zu werden, dachte er sich ein System aus, mit dem er den Screening-Prozess zumindest teilweise automatisieren konnte.
Die zentrale Komponente von Fuquas Screening-Plattform ist ein Mikroplatten-Wascher namens Flyspresso, der die Fixierung und X-Gal-Färbung der Embryos übernimmt (Sci. Rep. 11: 10314). Genau genommen hat nicht Fuqua Flyspresso entworfen, sondern der amerikanische Ingenieur Jeff Jordan, der einige Jahre als Berater für Crockers Gruppe am EMBL fungierte und mittlerweile für eine kanadische Firma Roboter entwickelt. Entsprechend professionell und ausgeklügelt wirken das Design und das Flüssigkeitsmanagement des Flyspresso. Mit einem komplizierten hydraulischen System aus Pumpen und Ventilen werden die benötigten Fixier- oder Färbelösungen aus den Vorratsflaschen gesaugt und über einen Spritzen-basierten Dispensierkopf in eine 24-Well-Platte mit den vorbereiteten Fliegenembryos geleitet. Die Steuerung der Plattform übernimmt, wie bei Open-Source-Systemen üblich, ein Microcontroller von Arduino.
Den Flyspresso nachzubauen, dürfte aber nicht ganz einfach sein. Wer sich dennoch an diese knifflige Aufgabe herantraut, findet alle Daten für Konstruktion, Steuerung und Programmierung auf GitHub.
Mikroplatten-Wascher im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 3/2022, Stand: Februar 2022, alle Angaben ohne Gewähr)