Info

Elektrische, chemische und mechanische Türöffner
Produktübersicht: Transfektions-Systeme

Transfektions-Systeme im Überblickpdficon

(12.04.2022) Die Transfektion von Zellen ist eine der grundlegendsten Technikenin biowissenschaftlichen Laboren. Entsprechend vielfältig und ausgeklügelt sind die verwendeten Transfektions-Systeme.

Als der US-amerikanische Bakteriologe Marshall Barber in seinem Labor an der University of Kansas an einer mit Quecksilber gefüllten Glaskapillare herumbastelte, mit der er Bakterien in die Vakuole von Pflanzenzellen injizieren wollte, wusste die Welt noch nichts von DNA oder RNA. Kein Wunder, denn Barber konstruierte seinen Bakterien-Injektor bereits 1911. In das hauchdünn ausgezogene Ende der Kapillare sog er eine Bakterien-Suspension ein, das andere mit mehreren spiralförmigen Windungen versehene Ende belud er mit Quecksilber und verschloss es anschließend. Erwärmte Barber das Quecksilber, dehnte sich das verdampfende Schwermetall mit einem Schlag aus und schleuderte die Bakterien-Lösung mit ordentlich Schmackes aus der Kapillare heraus. Um zu verhindern, dass nicht nur die Bakterien, sondern auch Teile des Quecksilbers in den Vakuolen landeten, kühlte er das Quecksilber nach der Injektion sofort mit Eis (J. Infect. Dis. 8 (3): 348-60).

p_22_04a
Trotz Unterstützung durch Joystick, Mikromanipulatur und Monitor ist die Fummelei bei der Mikroinjektion von Maus-Zygoten nur etwas für Spezialisten mit ruhigen Händen. Foto: MRC Harwell Institute

Info

Barbers Bakterien-Injektor war zugegebenermaßen eine ziemlich wilde Konstruktion und vermutlich hüpften in jedem Winkel seines Labors kleine Quecksilber-Tröpfchen umher. Mit seiner gewitzten Apparatur nahm er aber bereits vor mehr als hundert Jahren die Funktionsweise von Mikroinjektoren vorweg, die heute gemeinsam mit verschiedenen anderen Techniken für die Transfektion eukaryotischer Zellen mit Nukleinsäuren eingesetzt werden.

In modernen Mikroinjektoren werden die gewünschten Substanzen natürlich nicht mehr mit expandierendem Quecksilber in die Zelle befördert, sondern mit äußerst fein einstellbaren Pico-Pumpen. Und die Injektions-Nadel führt der Experimentator auch meist nicht mehr mit der Hand – das übernimmt in der Regel ein mit dem Joystick oder Roboter gesteuerter Mikromanipulator. Die Nadel selbst ist aber wie zu Barbers Zeiten häufig eine Glaspipette, die an einem Ende zu einer kaum einen halben Mikrometer dicken Kapillare ausgezogen wurde. Mikroinjektoren werden insbesondere von Entwicklungsbiologen verwendet, etwa um transgene Mäuse oder Zebrafische zu erzeugen. Dazu injizieren sie die fremde DNA mithilfe der Glaskapillare direkt in den Pronukleus von Maus-Zygoten beziehungsweise in Fischembryos im Ein-Zell-Stadium.

Die Transfektion mit Mikroinjektoren ist äußerst präzise und effektiv, erfordert aber viel Übung und ist nicht gerade für den Hochdurchsatz geeignet – es sei denn, man hat das nötige Kleingeld für ein Roboter-gesteuertes Instrument. In biowissenschaftlichen Laboren, die überwiegend mit gängigen Zellkulturen arbeiten, sieht man Mikroinjektoren deshalb nur selten. Hier werden die Nukleinsäuren meist mit Elektroporatoren oder chemischen Transfektions-Methoden in die Zellen eingeschleust.

Der Elektroporator ist zwar nicht ganz so alt wie Barbers Mikroinjektor, hat aber auch schon ein paar Jährchen auf dem Buckel und feiert im Juni sein vierzigjähriges Jubiläum. Erfunden wurde er von dem Physikochemiker Eberhard Neumann und seinem Mitarbeiter Tai-Kin Wong, damals am Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried. Neumann war zwar nicht der Erste, der die Auswirkungen starker elektrischer Spannungen auf die Strukturen von Zellmembranen untersuchte – der Membranforscher Ullrich Zimmermann hatte bereits Anfang der Siebzigerjahre am Institut für Biophysikalische Chemie der Kernforschungsanlage Jülich entdeckt, dass die Membran von E.-coli-Zellen nach einem Spannungsimpuls für Ionen reversibel durchlässig wird. Auf die Idee, diesen „elektrischen Durchbruch“ auszunutzen, um DNA in Zellen zu transferieren, kamen aber erst Neumann und Wong. Die beiden mischten hierzu Plasmid-DNA und suspendierte Mauszellen in einer Elektroporations-Küvette und schlossen sie an einen mit Spannung aufgeladenen Kondensator an. Entluden sie den Kondensator, jagte dieser Spannungsstöße von mehreren Kilovolt pro Zentimeter durch die Küvette, die innerhalb weniger Mikrosekunden exponentiell abfielen und hierdurch keine signifikante Temperaturerhöhung produzierten. Spätestens nach drei Spannungsimpulsen waren die Zellmembranen sturmreif geschossen, öffneten ihre Poren und ließen die Plasmid-DNA ins Innere der Zellen passieren.

An diesem Funktions-Prinzip hat sich auch in modernen Elektroporatoren nichts Wesentliches geändert. Sie sind aber deutlich komfortabler, erzeugen zusätzlich zu den exponentiell abfallenden oft auch rechteckig verlaufende Spannungsimpulse und verfügen meist über zahllose programmierte Transfektions-Protokolle, deren Spannungs-Parameter bereits an die gewünschten Zellen angepasst sind. Nach den Angaben der Elektroporator-Hersteller liegt die maximale Transfektions-Effizienz für Plasmid-DNA bei über neunzig Prozent. Je effizienter die Elektro-Transfektion, desto geringer ist aber zumeist auch die Lebensfähigkeit der transfizierten Zellen. Und offensichtlich hängen Viabilität und Transfektions-Effizienz sehr stark von der Magnesiumionen-Konzentration des verwendeten Transfektions-Puffers ab. Zu diesem Ergebnis kam die Gruppe des Bioingenieurs Jeffrey Zahn, die an der Rutgers University New Brunswick, USA, an Mikrofluidik-basierten Transfektions-Geräten arbeitet (Sci. Rep. 10: 3053).

Das Team transfizierte NIH-3T3-MausFibroblasten via Elektroporation mit Plasmid-DNA und suspendierte die Zellen dazu in einem HEPES-Puffer mit konstanten Mengen Sucrose oder Trehalose, jedoch variierenden Konzentrationen von Magnesium- und/oder Kaliumionen. Das ausgewogenste Ergebnis mit einer Lebensfähigkeit von 93 Prozent sowie einer Transfektions-Effizienz von 56 Prozent erzielten die US-Amerikaner nach einem moderaten Spannungsimpuls (2,4 kV/cm) mit einem Puffer, der neben Kalium- auch Magnesiumionen enthielt. Die Erklärung der Gruppe für dieses Phänomen ergibt durchaus Sinn: Die Magnesiumionen knapsen zwar ein wenig von der Transfektions-Effizienz ab, sie sind aber auch essenzielle Cofaktoren für überlebenswichtige Enzyme und erhöhen hierdurch die Viabilität der transformierten Zellen.

Ganz ohne teure Geräte kommen chemische Transfektions-Methoden aus, die verschiedene Substanzen für den Transport der Nukleinsäuren in die Zellen nutzen. Das dienstälteste und einfachste Transfektions-Reagenz ist Calciumphosphat, das Frank Graham und Alex Jan van der Erb bereits 1973 einsetzten, um KB-Zellen (HeLa-Zellen) mit Adenovirus-DNA zu infizieren. Die positiv geladenen Calciumionen binden an das negativ geladene Rückgrat der DNA und bilden mit diesem einen unlöslichen Komplex, der sich an die Zelloberfläche anlagert und durch Endocytose in die Zellen aufgenommen wird.

Wechselspiel der Ladungen

Auf diesem Wechselspiel zwischen negativ geladener Zelloberfläche und positiv geladenem Transfektions-Komplex basieren nahezu alle weiteren Transfektions-Reagenzien, die seit Grahams und Erbs Calciumphosphat-Methode entwickelt wurden. Neben kationischen Polymeren, wie zum Beispiel Polyethylenimin, machten hier insbesondere kationische Lipide das Rennen. 1987 führte Mark Danielsens Gruppe an der Stanford University School of Medicine in Kalifornien das kationische Lipid DOTMA (1,2-Di-O-octadecenyl-3-trimethylammoniumpropan) für die Lipofektion von COS-7-Zellen ein (Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 7413-17).

Inzwischen ist das Angebot kommerzieller Reagenzien für die Lipofektion kaum noch zu überblicken. Unter Markennamen wie Lipofectamin, Dharmafect, HiPerfect, MegaFectin, Endofectin oder Nanofectamin verstecken sich häufig die Lipide DOTMA, DOTAP, (N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium-methylsulfat) sowie DOSPA (2,3-Dioleyloxy-N-[2-(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoroacetat), oft in unterschiedlichen Kombinationen und assistiert von Helfer-Lipiden, etwa DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin). Wie der Urvater DOTMA enthalten sie positiv geladene Kopfgruppen und hydrophobe Schwänze, die alleine oder mithilfe der Helfer-Lipide unterschiedlich große Liposomen oder Vesikel ausbilden. Negativ geladene Phosphat-Gruppen von DNA oder RNA binden an die polaren Kopfgruppen, wodurch leicht positiv geladene Komplexe (Lipoplexe) entstehen, die von der Zellmembran angezogen werden und schließlich mit dieser verschmelzen.

mRNA-Transfektion

Kationische Lipide beziehungsweise Lipoplexe wurden ab dem Ende der Achtzigerjahre auch für den Transport von mRNA in Zellen eingesetzt – allerdings nicht immer mit dem erhofften Erfolg. Forscher kämpften häufig mit der mangelnden Stabilität und unflexiblen Zusammensetzung der Lipoplexe sowie einer ineffizienten Transfektion. Sie kamen deshalb auf die Idee, die Lipide mit einigen Tricks in stabilere Lipid-Nanopartikel umzuwandeln, die derzeit insbesondere als Transportvehikel für mRNA-basierte SARS-CoV-2-Impfstoffe für Furore sorgen.

Die zentralen Komponenten von Lipid-Nanopartikeln sind kationische oder pH-responsive Lipide, die bei niederen pH-Werten positiv geladen sind, neutrale Helfer-Lipide wie zum Beispiel DOPE sowie Polyethylenglycol (PEG)-Lipide beziehungsweise pegylierte Lipide. Erstere schließen die mRNA in einer Lipid-Kapsel ein, DOPE stabilisiert die Lipid-Doppelschicht der Nanopartikel und PEG bildet schließlich eine Hydratschicht auf den Partikeln, die ihre Stabilität in den Zellen erhöht. Die Herstellung der Lipid-Nanopartikel ist weit weniger kompliziert als man vermuten würde: Die in Ethanol gelösten Lipide werden dazu unter kontrollierten Bedingungen mit einer sauren Pufferlösung gemischt, in der sich die mRNA befindet.

Die Transfektion von mRNA ist aber nicht nur für die Verabreichung von mRNA-Vakzinen von Bedeutung, sondern auch für etliche andere klinische Anwendungen etwa mRNA-basierte Immuntherapien mithilfe von Chimären-Antigen-Rezeptoren (CAR), die in T-Zellen exprimiert werden. Bei der CAR-T-Zell-Therapie werden T-Zellen des Patienten entnommen und ex vivo mit DNA oder mRNA transfiziert, die für die gewünschten CAR codieren. Meist verwenden die Forscher für die mRNA-Transfektion der Lymphozyten ein Elektroporations-Gerät. Ganz zufrieden sind sie damit aber nicht, und auch andere gängige Transfektions-Verfahren wie zum Beispiel Adeno-assoziierte-Viren, Lipofektion oder Mikroinjektion haben Schwächen.

Mechanoporation

Etliche Gruppen experimentieren deshalb mit alternativen Konzepten, etwa Licht-aktivierten- (Photoporation) oder akustischen Transfektions-Systemen (Sonoporation). Sehr vielversprechend sind auch zellmechanische Transfektions-Techniken. So entdeckte zum Beispiel Allen Lius Gruppe an der University of Michigan in den USA, dass Zellen Substanzen aufnehmen, wenn sie nur kurz deformiert werden und sich danach wieder rasch ausdehnen können (Small 16: e1903857). Lius Team nennt diesen Prozess, bei dem sich während der Expansion Membranporen bilden, Volume Exchange for Convective Transfection (VECT).

Das US-Start-up cellFE konstruierte auf Basis von Lius Erkenntnissen einen speziellen Mikrofluidik-Kanal mit einer kammartigen Struktur für die sogenannte Mechanoporation (Sci. Rep. 11: 21407). Fließen Zellen durch den Kanal, müssen sie immer wieder unter schmalen Barrieren hindurchschlüpfen, die von oben in den Kanal hineinragen, und gelangen danach jeweils in einen etwas höheren Zwischenraum. Unter den Barrieren werden die Zellen extrem rasch zusammengepresst, in den darauf folgenden Zwischenräumen dehnen sie sich wieder aus. Strömen neben den Zellen auch mRNA-Moleküle durch den Kanal, transportieren die Zellen sie während der Expansionsphasen in das Cytosol.

Sind die Fließgeschwindigkeit und der Engpass unter den Barrieren optimal eingestellt, erleiden die Zellen durch die vorübergehende Deformation keinen Schaden. Das Team von cellFE schleuste mit der Mechano-Transfektion mRNA in T-Zellen, Natürliche Killerzellen sowie hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen und erreichte Überlebensraten von 70 bis 90 Prozent sowie eine Transfektions-Effizienz von 60 bis 80 Prozent. Das kann sich nicht nur im Vergleich mit anderen mechanischen Transfektions-Systemen durchaus sehen lassen.

Transfektions-Systeme pdficon


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 4/2022, Stand: März 2022, alle Angaben ohne Gewähr)




Letzte Änderungen: 12.04.2022