(11.03.2020) Kits für die Isolierung von Zellen basieren meist auf magnetischen Kügelchen, die an zellspezifische Antikörper gekoppelt sind. Noch günstiger und genauso selektiv wie Antikörper sind Aptamere.
Bis in die Neunzigerjahre war die Isolation von Zellen oft eine mühsame Plackerei. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierer (FACS) waren für normale Labore zu teuer. So blieb in vielen Fällen nur die Dichtegradienten-Zentrifugation als gängiges Trennverfahren übrig, um eine gewünschte Zellpopulation aus einer heterogenen Ausgangsmischung herauszufischen. Bei der Dichtegradienten-Zentrifugation überschichtet man ein zähflüssiges Dichte-Medium, meist aus Ficoll oder Percoll, in einem Zentrifugenröhrchen mit dem Probenmaterial, etwa Blut oder Leberzellen. Anschließend zentrifugiert man so lange, bis sich innerhalb des Mediums ein Dichtegradient ausbildet. Schwere Zellen, wie zum Beispiel Erythrozyten, sammeln sich in den dichteren Zonen am Boden des Röhrchens, während sich die leichten, etwa mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC), in den darüberliegenden anreichern.
Rote Blutkörperchen werden meist mit einer Dichtegradienten-Zentrifugation von anderen Blutzellen getrennt. Schneller geht es mit der Auftriebs-aktivierten Zellsortierung. Foto: NSF
Die Dichtegradienten-Zentrifugation ist mit der nötigen Routine einfach durchzuführen und wird auch heute noch für die Isolation von PBMC-Zellen eingesetzt. Sie ist aber ziemlich zeitaufwendig und nicht gerade für den Hochdurchsatz geeignet. Zudem hängt die Reinheit der isolierten Zellen von der Geschicklichkeit des Experimentators ab. Insbesondere bei den Pipettier-Schritten muss dieser penibel darauf achten, keine unerwünschten Zellen aus benachbarten Schichten des Dichtegradienten zu erwischen.
Die Zellisolierer in den Laboren waren deshalb sicher nicht böse, als Anfang der Neunzigerjahre magnetische Kügelchen für die Separation von Zellen auftauchten, die die Zellisolierung deutlich vereinfachten. Der Polymerchemiker Alan Rembaum vom Jet Propulsion Laboratory in Pasadena experimentierte bereits Mitte der Siebzigerjahre mit magnetischen Kügelchen, deren Oberflächen mit zellbindenden Molekülen bestückt waren. Mit seinem Mitarbeiter Robert Molday entwickelte er ein simples Verfahren, mit dem sie aus einer mit Eisenchlorid versetzten Dextran-Lösung winzige Dextran-Kügelchen (Beads) mit einem magnetischen Kern aus Eisen erzeugen konnten.
Die Dextran-Hülle konjugierten die beiden mit Antikörpern gegen die gewünschten Zellen oder mit Lektin. Anschließend luden sie die magnetischen Kügelchen inklusive der daran haftenden Zellen auf eine Säule, die von einem starken Elektromagneten umgeben war. Schalteten sie diesen an, wurden die magnetischen Kügelchen in der Säule zurückgehalten und konnten anschließend bei abgeschaltetem Magneten von der Säule gespült werden.
Dieses genial einfache Konzept hatte aber einen kleinen Haken: Die Magnetisierung der winzigen superparamagnetischen Kügelchen durch das etwa 1 Tesla starke Magnetfeld des Elektromagneten war äußerst schwach, die Separation der Zellen dauerte deshalb sehr lange. Molday versuchte schließlich, die Magnetkräfte im Inneren der Säule mit einem Geflecht aus einem 25 Mikrometer dicken rostfreien Stahldraht zu erhöhen.
Das war schon mal keine schlechte Idee, die Verstärkung des Magnetfeldes reichte aber noch nicht aus. Auf den entscheidenden Kniff kam schließlich Stefan Miltenyi, der 1987 in Andreas Radbruchs Gruppe am Institut für Genetik der Universität Köln eine Diplomarbeit über die Isolierung von Zellen mit magnetischen Beads anfertigte: Miltenyi ersetzte Moldays Drahtgeflecht durch eine plastikbeschichtete Edelstahlwolle, mit der er etwa zwei bis vier Prozent des Säulenvolumens füllte. Bereits dieser geringe Volumenanteil genügte, um die magnetischen Kräfte in der Säule drastisch zu erhöhen, wenn sie in einem Magnetfeld platziert wurde. Die ferromagnetische Stahlwolle stört das Magnetfeld und erzeugt in unmittelbarer Nähe der dünnen Stahldrähte extrem starke Magnetkräfte, die die Eisenferrit-Kerne der Beads sofort zu den Drähten ziehen und dort vehement festhalten.
Miltenyi koppelte Biotin an die Dextranhülle der magnetischen Beads und markierte die Zellen, die er aus einer Zellprobe herausfischen wollte, via biotinylierter Antikörper mit Streptavidin. Danach mischte er Beads und Zellen, trug sie auf die Säule auf, platzierte diese im Magnetfeld des MACS-Geräts und spülte die separierten Zellen nach Entfernen des Magneten in ein Auffanggefäß.
Mittlerweile wurde die Stahlwolle in den MACS-Säulen von kleinen Stahlkügelchen abgelöst, und zur Markierung der Zellen mit biotinylierten Antikörpern sind etliche neue Varianten hinzugekommen. Am grundlegenden Prinzip der Zellisolierung mit magnetischen Beads hat sich aber seit Miltenyis MACS-Prototyp praktisch nichts verändert. Da der Umgang mit den kleinen Magnetkügelchen kinderleicht ist, avancierten sie inzwischen zu den Favoriten bei der Zellisolierung und sind auch in vielen Kits anzutreffen.
Die magnetische Zellisolierung kann aber auch in puncto Durchsatz, Ausbeute sowie Viabilität der isolierten Zellen mit der Konkurrenz mithalten, die im Wesentlichen aus der Fluoreszenz-aktivierten Zellisolierung (FACS) mit entsprechenden Zellsortierern besteht.
Dies ist zumindest die Schlussfolgerung eines Papers, das Bryan Sutermaster und Eric Darling von der Brown University in Providence, USA, im letzten Jahr veröffentlichten (Scientific Reports 9: 227). Die beiden wollten genau wissen, wie sich MACS gegenüber FACS schlägt und führten einen Vergleichstest durch. Als Testkandidaten suchten sie sich Stammzellen aus dem Fettgewebe aus, die den Oberflächenmarker ALPL (alkalische Phosphatase/Leber/Knochen/Niere) exprimieren. Sutermaster und Darling markierten die Stammzellen mit anti-ALPL-Antikörpern und mischten sie in verschiedenen Verhältnissen mit Melanoma-Zellen. Anschließend isolierten sie ALPL-positive Zellen mit FACS sowie MACS aus der Zellmischung und verglichen die beiden Methoden.
An den Ergebnissen der beiden gibt es nicht viel zu rütteln: Die Isolierung der ALPL-positiven Zellen mit MACS ist deutlich schneller, liefert höhere Ausbeuten, und auch die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen ist erheblich besser. Sutermaster und Darling mussten dem MACS-Verfahren aber etwas auf die Sprünge helfen – mit dem ursprünglichen Protokoll konnten sie so gut wie keine ALPL-positive Zellen isolieren. Erst als sie sowohl die Konzentration der Antikörper für die Markierung der Zellen wie auch die Zahl der Beads deutlich erhöhten, verlief die Isolierung ALPL-positiver Zellen mit MACS schneller, gründlicher und schonender als mit dem FACS-Gerät.
Mit fast noch geringerem methodischen Aufwand als bei MACS lassen sich Zellen mit der sogenannten Auftriebs-aktivierten Zellsortierung (BACS) trennen. Statt magnetischer Kräfte nutzt das von Mehmet Toners Gruppe am Massachusetts General Hospital in Boston entwickelte BACS-Verfahren die Auftriebskraft in Flüssigkeiten, um Zellen zu separieren.
Für BACS werden zunächst Zell-spezifische Antikörper auf der Oberfläche von kleinen, hohlen Glaskügelchen (Microbubbles) immobilisiert. Anschließend mischt man die Glas-Beads in einem Reaktionsgefäß gründlich mit den zu isolierenden Zellen, etwa CD4-positiven T-Zellen aus peripherem Blut. Wie kleine Schwimmbojen steigen die hohlen Kügelchen mit den daran haftenden Zellen an die Flüssigkeits-Oberfläche und können mit der Pipette abgehoben werden.
Mittlerweile hat das US-Start-up Akadeum Life Sciences Toners Idee aufgenommen und einen BACS-Kit mit gasgefüllten Microbubbles entwickelt. Mit diesem lassen sich rote Blutkörperchen innerhalb weniger Minuten gründlich aus peripherem Blut entfernen, bevor man aus diesem zirkulierende Tumorzellen isoliert.
Der größte Kostenfaktor bei der Isolierung von Zellen mit MACS ist die Herstellung der notwendigen Antikörper. Mit einer MACS-Variante, die Suzie Hwang Puns Gruppe von der University of Washington Ende letzten Jahres vorstellte, kann man jedoch auf die Antikörper verzichten und gleichzeitig die isolierten Zellen von jeglichen Spuren des Trennvorgangs befreien. Pun erreichte dies mit einem recht simplen Trick: Sie ersetzte die Antikörper ganz einfach durch Aptamere (Nature Biomedical Engineering 3: 783-95).
Aptamere sind kleine, einzelsträngige Oligonukleotide, die ihre Zielmoleküle mit ähnlich hoher Affinität und Spezifität binden wie Antikörper. Im Gegensatz zu Antikörpern können sie jedoch kostengünstig synthetisch hergestellt werden und lassen sich problemlos längere Zeit lagern. Beim Standardverfahren zur Aptamerproduktion, dem SELEX-Prozess (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), gibt man das Zielmolekül zu einer Bibliothek mit unzähligen Oligo-Varianten. Durch wiederholte Runden von Binden, Aufteilen und Amplifizieren isoliert man aus der Bibliothek schließlich Aptamere, die sich selektiv und hochaffin auf dem anvisierten Zielmolekül festsetzen.
Pun wollte mit den Aptameren CD8-positive T-Zellen aus PBMCs isolieren und anschließend für die Chimeric-Antigen-Receptor-(CAR)-T-Zell-Therapie einsetzen. Mit den üblichen SELEX-Protokollen funktionierte die Selektion der Aptamere jedoch nicht. Ihr Team etablierte deshalb eine sehr ausgeklügelte SELEX-Strategie, die auf einer positiven Selektions-Runde mit T-Zellen sowie mehreren negativen mit PBMCs basiert. Mit ihrer SELEX-Variante isolierten Puns Mitarbeiter schließlich drei Aptamere, die ähnlich stark an CD8-positive Zellen binden wie ein entsprechender Antikörper.
Den vielversprechendsten Aptamer-Kandidaten verknüpften die Wissenschaftler mit magnetischen Beads, die sie danach für die magnetische Separation CD8-positiver Zellen auf einer Trennsäule einsetzten. Das war Pun aber noch nicht genug – sie wollte die Aptamer-Beads auch wieder rückstandslos von den isolierten CD8-positiven T-Zellen entfernen. Theoretisch könnte man dies mit verschiedenen Techniken erreichen, etwa mithilfe einer Nuklease, die das Aptamer zerschneidet, oder durch Hitzedenaturierung der Sekundärstruktur.
Puns Team wählte jedoch eine viel einfachere und auch schonendere Methode: Ihre Mitarbeiter konstruierten einen komplementären Strang, der mit dem Aptamer hybridisiert und dessen Sekundärstruktur durcheinanderbringt. Das Aptamer verliert hierdurch seine hohe Affinität zu CD8-positiven Zellen und trennt sich von diesen. Konkret gibt man nach der magnetischen Trennung der CD8-positiven Zellen einfach einen hundertfachen Überschuss des komplementären Strangs zu, wodurch sich die an die Aptamere gebundenen CD8-positiven Zellen augenblicklich ablösen und von der Säule gespült werden.
Das klingt wesentlich einfacher als die auf rekombinanten Antikörperfragmenten basierende Release-Technik, mit der man auch beim klassischen MACS-Verfahren anhaftende Magnet-Beads von den isolierten Zellen entfernen kann. Puns Aptamer-MACS-Methode ist jedoch noch nicht als Zellisolations-Kit erhältlich – aber was nicht ist, kann ja noch werden.
Zellisolierungs-Kits im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 3/2020, Stand: Februar 2020, alle Angaben ohne Gewähr)