(09.02.2020) Dank neuer Heiztechniken sind einige Thermocycler so zusammengeschrumpft, dass sie inzwischen in die Hosentasche passen. Und der Trend zu immer kleineren Geräten geht munter weiter.
Noch dominieren Peltier-gesteuerte Aluminiumblöcke die Heiztechnik in Thermocyclern für die klassische PCR. In den letzten Jahren tauchten jedoch immer mehr Geräte mit alternativen Heiz- und Kühlkonzepten auf, die den Blockcyclern inzwischen mächtig Konkurrenz machen. Auf Dauer könnte diesen der schwere Aluminiumklotz in ihrem Inneren zum Verhängnis werden. Dieser wirkt sich nicht nur nachteilig auf das Gewicht der Geräte aus: Die Heizung und Kühlung des massiven Blocks mit Peltier-Elementen verschlingt auch sehr viel Energie.
Entsprechend groß ist der Stromverbrauch von Blockcyclern, die meist mehrere hundert Watt aus der Steckdose ziehen. Darüber hinaus sind auch den Heiz- und Kühlraten des Blocks durch die thermische Leitfähigkeit und spezifische Wärmekapazität von Aluminium physikalische Grenzen gesetzt: Viel mehr als zehn Grad Celsius pro Sekunde sind mit üblichen Blockcyclern nicht drin.
NASA-Astronaut Nick Hague ist von seinem kleinen tragbaren Thermocycler an Bord der ISS-Raumstation offensichtlich begeistert. Er untersuchte mit ihm, welche DNA-Schäden die Weltraumstrahlung verursacht, und wie diese von den Zellen in der Schwerelosigkeit repariert werden. Foto: NASA
Die Aluminiumblöcke flogen deshalb als erstes aus den Entwürfen für alternative Heizkonzepte heraus. An ihre Stelle traten unterschiedliche Heizverfahren, wie zum Beispiel Heißluft, magnetische Induktion, Wasserbäder oder sandwichartige Heizplatten, die bereits in den letzten Produktübersichten zu Thermocyclern (LJ 12/2016) sowie qPCR-Geräten (LJ 12/2015) vorgestellt wurden.
In diesen Cyclern fehlt zwar der klobige Alublock. Sie sind aber mit Ausnahme des magnetischen Induktions-Cyclers nicht viel kleiner als klassische Blockcycler. Insbesondere bei tragbaren Mini-Cyclern setzen die Entwickler deshalb auf Widerstandsheizungen oder Thermofolien, mit denen sich äußerst handliche Thermocycler konstruieren lassen. Da diese nur wenige Watt verbrauchen und mit einer kleinen Batterie oder einem Akku betrieben werden können, eignen sie sich nicht nur für das Labor, sondern auch für den Einsatz in der freien Natur, etwa bei Feldstudien.
Ein Beispiel hierfür ist der miniPCR-Thermocycler, den die US-Molekularbiologen Ezequiel (Zeke) Alvarez-Saavedra und Sebastian Kraves mit ihrem Start-up Ampylus entwickelten. Auf den ersten Blick sieht der nur handtellergroße miniPCR mit seinem durchsichtigen Plexiglas-Gehäuse wie eine typische Eigenkonstruktion aus einer Institutswerkstatt aus – nicht gerade schick, aber grundsolide und stabil.
Hinter dem Plexiglas erkennt man die vier wesentlichen Bauteile des Cyclers, die direkt übereinander angeordnet sind: Einen beheizten Deckel, eine rechteckige Heizplatte mit acht oder sechzehn Aussparungen für die PCR-Tubes, einen Ventilator sowie eine Steuerplatine. In die Heizplatte ist eine Dünnschicht-Widerstandsheizung eingebaut, die wie die Heckscheibenheizung eines Autos funktioniert und sich erwärmt, sobald ein Strom durch sie hindurch fließt. Gekühlt wird die Platte mithilfe des direkt darunter liegenden Ventilators.
Der Aufbau des miniPCRs mit den übereinander angeordneten Bauteilen und der Dünnschicht-Widerstandsheizung ist keine wirklich neue Idee. Avraham Rasoolys Gruppe vom National Cancer Institute in Bethesda, USA, stellte schon vor zehn Jahren einen sogenannten Thin-Film Resistive Thermocycler (TFRT) vor, der ganz ähnlich aufgebaut ist wie der miniPCR. Der größte Unterschied sind waagerecht auf der Heizplatte angebrachte Kapillaren für die PCR-Reaktion sowie die Anordnung eines Ventilators, jeweils über und unter der Heizplatte (Methods Mol. Biol. 504: 441-58).
Im Gegensatz zum miniPCR kam der TFRT-Cycler aber nie über das Konzept-Stadium hinaus. Die beiden Ampylus-Gründer waren in dieser Beziehung deutlich cleverer als Rasooly. Keine zwei Jahre nach den ersten Versuchen mit einem noch unausgegorenen miniPCR-Modell im Jahr 2012 warben sie unter anderem mithilfe der Start-up-Finanzierungsplattform Kickstarter genügend Geld ein, um den miniPCR in größeren Stückzahlen zu produzieren. Kurz darauf initiierten sie zusammen mit der NASA den Genes-in-Space-Wettbewerb, bei dem amerikanische Highschool-Schüler molekularbiologische Experimente vorschlagen können, die auf der Internationalen Raumstation ISS durchgeführt werden sollen. 2016 wurde der miniPCR schließlich für die erste PCR im All verwendet. Auch sonst scheint das Geschäft für das Start-up ganz gut zu laufen, das inzwischen neben dem miniPCR noch weitere Eigenkreationen für die Molekularbiologie anbietet.
Ebenfalls nicht viel größer als eine Hand und nur etwas über ein Kilogramm schwer ist der batteriebetriebene Thermocycler Franklin des US-Start-ups Biomeme. Biomemes Weg verlief nahezu parallel zu dem von Ampylus: Gegründet wurde es 2012 von dem Elektrochemiker und Ingenieur Marc DeJohn, dem Biologen Jesse vanWestrienen sowie dem Geschäftsmann Max Perelman. Bereits 2015 folgten erste beta-Tests mit einem Thermocycler-Prototyp, der 2016 zunächst als two3 auf den Markt kam. Mittlerweile haben die Drei diesen zum Thermocycler Franklin weiterentwickelt, den sie im April letzten Jahres vorstellten.
Franklins Design ist deutlich schicker als das des eher bieder daherkommenden miniPCR. Auch sein Innenleben ist um einiges ausgeklügelter – er lässt sich sogar als qPCR-Cycler verwenden. Wie der miniPCR wird auch Franklin mit elektrothermischen Elementen beheizt und mit einem Miniventilator gekühlt.
Im Unterschied zum miniPCR sitzen die PCR-Tubes aber nicht in den Löchern einer durchgehenden Heizplatte, sondern in neun, jeweils separat beheizten kleinen Miniheizblöcken, die wie auf einer Perlenschnur hintereinander aufgereiht sind. Über eine kleine Öffnung in den Miniblöcken gelangt Anregungslicht für die Detektion der qPCR in die PCR-Tubes. Durch eine zweite Öffnung wird emittiertes Licht auf das optische System des Thermocyclers gelenkt, das sich in einer Aussparung unter den Miniheizblöcken von einem PCR-Tube zum anderen bewegen kann.
In der einfachsten Ausführung ist Franklin mit nur einem Farbkanal (Grün) ausgestattet, die zwei weiteren Varianten können eine (Rot) oder zwei weitere Farben (Rot und Orange) detektieren.
Die im Gegensatz zum miniPCR deutlich aufwendigere Technik macht sich auch im Preis bemerkbar. Das Ein-Farben-Modell kostet etwas mehr als 5.000 Euro, für die Drei-Farben-Variante muss man gut 9.000 Euro hinblättern. Dagegen sind die knapp 600 Euro für den miniPCR schon fast ein Schnäppchen.
In etlichen Forschungs- und Entwicklungslaboren wird aber eifrig an noch kleineren Thermocyclern gearbeitet. Diese basieren meist auf hauchdünnen Polymerfolien, die sich sehr schnell aufheizen, wenn sie von einem Strom durchflossen werden und sich mit Miniventilatoren ebenso schnell kühlen lassen. So konstruierten zum Beispiel Forscher der amerikanischen Biotech-Firma GM Biosciences einen PCR-Chip aus einer transparenten, leitenden Graphen-Folie. Wie ein Sandwich wird diese über einen kleinen Thermofühler sowie zwei Reaktions-Näpfchen geklappt und an einen Microcontroller angeschlossen, der die Stromzufuhr sowie einen winzigen Ventilator steuert. Eine positiv verlaufende PCR wird durch eine Farbreaktion angezeigt, die durch die Graphen-Folie hindurch mit bloßem Auge zu sehen ist.
Die einzelnen Teile des Graphen-Cyclers sind so billig, dass nicht nur der PCR-Chip nach einmaligem Gebrauch weggeworfen wird, wie in einigen anderen Cycler-Modellen: Der komplette Thermocycler samt Ventilator und elektronischer Steuerung ist als Einmal-Cycler vorgesehen, der nach der PCR in den Müll wandert (biorxiv http://dx.doi.org/10.1101/724245).
Völlig ohne Heizblöcke oder elektrische Widerstandsheizungen funktioniert eine Thermocycler-Heizung, die das Team des Bioingenieurs Luke P. Lee an der University of Berkeley in Kalifornien ausgetüftelt hat (Light: Science & Applications 4: e280).
Die Kalifornier erhitzen die PCR-Ansätze mit Licht und nutzen dabei eine genauso verblüffende wie interessante Eigenschaft metallischer Nanopartikel: Fällt Licht auf die Partikel, wird es nicht reflektiert, wie bei einem makroskopischen Stück Metall, sondern absorbiert. Das elektromagnetische Feld des Lichts wechselwirkt mit den Elektronen im Leitungsband des Metalls, die hierdurch gemeinsam dazu angeregt werden, mit der Frequenz des Feldes zu oszillieren. Schwingen diese sogenannten Plasmonen in Resonanz mit den Lichtwellen, wird das Licht sehr stark absorbiert und die dadurch aufgenommene Energie als Wärme freigesetzt.
Um dieses Phänomen für die Heizung eines photonischen Thermocyclers zu nutzen, integrierten Lees Mitarbeiter spezielle PCR-Platten in eine hauchdünne Goldfolie. Wird diese mit einer LED-Lampe bestrahlt, steigt die Temperatur mit einer Heizrate von über 12 °C pro Sekunde auf die erforderliche Zyklus-Temperatur. Schaltet man die LED aus, kühlt die dünne Goldfolie auch ohne zusätzlichen Ventilator im Nu wieder ab.
Für eine PCR mit dreißig Zyklen benötigt Lees Photonen-Cycler kaum länger als fünf Minuten. Der Aufbau des Photonen-Cyclers lässt sich aber noch viel einfacher gestalten: Der Trick mit den Nanopartikeln funktioniert auch, wenn man die Goldpartikel direkt in den PCR-Ansatz gibt (Trends Biochem. Sci. 45(2): 174-75).
Mittlerweile hat Lees Gruppe den Photonen-Cycler in ein tragbares Diagnose-Gerät integriert, mit dem man in weniger als zwanzig Minuten Bakterien anreichern, lysieren und detektieren kann (ACS Nano 13(12):13866-74). Klar, dass in diesem auch die Lyse der Zellen auf photothermischem Weg vonstatten geht. Die Gruppe hat dazu eine goldbeschichtete Membran in das Gerät eingebaut, die zunächst dazu dient, die Mikroorganismen zu konzentrieren. Die vergoldete Membran fungiert aber gleichzeitig auch als plasmonischer Thermoaktuator für die Zelllyse. Wird sie mit einer Lichtenergie von weniger als einem Watt beleuchtet, steigt ihre Temperatur innerhalb weniger Sekunden auf 95 °C. Nach spätestens einer halben Minute sind die Bakterien aufgeschlossen und werden danach zur Plasmonen-beheizten PCR-Einheit geschleust.
Die Kalifornier wissen auch schon, wie sie die amplifizierte Mikroben-DNA künftig in einem weiterentwickelten Modell detektieren wollen: Mit einem in das optische System des Cyclers integrierten Smartphone. Und sie wissen auch, wie man aus der Photonen-PCR Kapital schlagen kann. Lees ehemaliger Mitarbeiter Jun Ho Son hat 2017 mit einem Kompagnon das Start-up Kryptos Biotechnologies mitgegründet, das mit der Technologie ein Gerät für die digitale PCR von Einzelzellen herstellen will.
Thermocycler im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 1-2/2020, Stand: Januar 2020, alle Angaben ohne Gewähr)