Nicht unbedingt auf den ersten Blick als Mikroskop zu erkennen: Das Lattice Light Sheet-Mikroskop. Foto: Nick Hamilton
Gut vier Jahre sind seit der letzten Produktübersicht zu Live-Cell-Imaging-Systemen vergangen. Höchste Zeit für ein Update.
Schon in der Übersicht in Laborjournal 12/2014 zeichnete sich ein Trend zu Lichtscheiben-basierten Mikroskopie-Verfahren für das Lebendzell-Imaging ab – Nobelpreisträger Eric Betzig hatte gerade mit einer Variante des Lichtscheibenmikroskops, dem sogenannten Lattice-Light-Sheet-(LLS)-Mikroskop, einen großen Coup gelandet. Von Betzigs LLS-Mikroskop ist mittlerweile auch eine kommerzielle Variante auf dem Markt. Der Preis des Instruments von weit über einer halben Million Euro dürfte aber das Budget der meisten Gruppen sprengen.
Wer dennoch von den bisher üblichen Live-Cell-Imaging-Verfahren, die meist Weitfeld- oder konfokale Fluoreszenzmikroskopie-Techniken nutzen, auf die zellschonendere Lichtscheibenmikroskopie (LSM) umsatteln will, muss nicht lange suchen. Neue, leistungsstarke Lichtscheibenmikroskope, die meist wesentlich günstiger sind als Betzigs Edel-Gerät, schießen derzeit wie Pilze aus dem Boden. Den Vater der LSM, Ernst Stelzer vom Buchmann Institut für Molekulare Lebenswissenschaften in Frankfurt, dürfte das besonders freuen – zumal auch einige seiner ehemaligen Mitarbeiter mit neuen Ideen für die Lichtscheibenmikroskopie glänzen.
Das Grundprinzip der LSM ist schnell erklärt: Die Fluoreszenz-gelabelte Probe wird mit einer hauchdünnen Lichtscheibe bestrahlt, die senkrecht zum Detektions-Objektiv orientiert ist und in dessen Fokusebene liegt. Das Objektiv sammelt die von den Fluorophoren ausgesandten Lichtsignale und leitet sie für die Bilderzeugung auf die lichtempfindlichen Chips einer CCD- oder CMOS-Kamera.
Je dünner die Lichtscheibe ist, desto weniger treten Artefakte durch Beugung, Streuung oder Absorption auf dem Weg durch die Probe auf – und als zusätzliches Bonbon sinkt die Strahlenbelastung, die zu Ausbleich- sowie phototoxischen Effekten in den untersuchten Zellen führt. Wird die Probe in winzigen Schritten durch die Lichtscheibe bewegt, entsteht ein dreidimensionales Bild des untersuchten Objekts.
2004 stellte Ernst Stelzers Gruppe das erste moderne Lichtscheibenmikroskop vor. Die Lichtscheibe erzeugte sein damaliger Mitarbeiter Jan Huisken zunächst mit einer zylindrischen Optik (Selective Plane Illumination Microscopy, SPIM). In einem Nachfolgemodell, das vier Jahre später fertig war, verwendete Stelzers Team einen punktförmigen Laserstrahl, der sich schnell hin und her bewegte, um die Lichtscheibe zu generieren (Digitally Scanned Light-sheet Microscope, DSLM). Auf diesen beiden Grundprinzipien basieren die meisten aktuellen Varianten des Lichtscheibenmikroskops.
Sowohl bei SPIM als auch bei DSLM fällt die Lichtscheibe durch ein Anregungs- beziehungsweise Illuminations-Objektiv auf die Probe, das im rechten Winkel zum Detektions-Objektiv montiert ist. Eigentlich sollte die Numerische Apertur (NA) der beiden Objektive so hoch wie möglich sein, um eine optimale Auflösung zu erzielen: Das Anregungs-Objektiv liefert in diesem Fall eine nur wenige Mikrometer dicke Lichtscheibe, während das Detektionsobjektiv maximal viel Licht einfängt. In der Praxis funktioniert dies jedoch nicht, weil Objektive mit hoher NA sehr klobig sind und sich durch die orthogonale Anordnung im LSM gegenseitig in die Quere kommen. Die Probe wird deshalb häufig mit einem Mindestabstand von etwa einem Millimeter vor der Linse des Detektions-Objektivs platziert, was eine entsprechend niedrige NA des Objektivs erfordert.
Bei der DSLM geht man meist den umgekehrten Weg. Hier schraubt man ein Illuminations-Objektiv mit niedriger NA in das Mikroskop, das eine etwas breitere, dafür aber tiefer in die Probe eindringende Lichtscheibe produziert, und kombiniert dieses mit einem Detektions-Objektiv mit hoher NA.
Den durch die Geometrie des Lichtscheibenmikroskops erzwungenen Einbau von Objektiven mit relativ niedriger NA kann man mit einem cleveren Trick umgehen, den die Gruppe des US-amerikanischen Zellforschers Paul Maddox entwickelte und Anfang des Jahres publizierte (J Cell Biol 217 (5): 1869). Maddox nennt die neue LSM-Variante „Lateral Interference Tilted Excitation (LITE)“-Mikroskopie.
Aus dem Namen lässt sich bereits erahnen, wie sein Team das Platzproblem der Objektive löste. Bei der LITE-LSM fokussiert man kohärentes Licht, das zusätzlich mit einer Photomaske strukturiert wird, mit einer zylindrischen Linse. Der hieraus resultierende keilförmige Lichtstrahl bildet am dünnen Ende des Keils eine Lichtscheibe, die etwa drei Zentimeter von der zylindrischen Linse entfernt liegt.
Dadurch gewinnt man den nötigen Platz, um ein Öl-Immersions-Objektiv mit hoher NA auf der Detektions-Seite montieren zu können. Um die Lichtscheibe exakt in der Fokusebene des Objektivs auszurichten, „kippt“ man die zylindrische Linse soweit, bis die untere Ebene des Lichtkeils parallel zur Fokusebene des Objektivs verläuft – daher die Bezeichnung Tilted Excitation.
In den Supplements des JCB-Papers finden sich detaillierte Pläne für den Bau des LITE-Moduls. Im Prinzip braucht man dazu lediglich einen 3D-Drucker sowie einige optische Bauteile, die man in einschlägigen Shops im Internet erhält. Das System installiert man schließlich auf dem Tisch eines inversen Mikroskops – fertig ist das LITE-LSM.
Maddox war aber clever genug, schon vor der Publikation des LITE-LSM seine eigene Firma Mizar Imaging zu gründen, die das Tilt-System herstellt. Die etwa 50.000 Euro, die das Start-up für das Lichtscheiben-Modul verlangt, sind zwar für die meisten Labore nicht gerade Peanuts. Im Vergleich zu ähnlichen Systemen, die in der Regel mehr als 200.000 Euro kosten, ist es aber immer noch relativ günstig.
Einen „Autopiloten“ für die Lichtscheibenmikroskopie stellte vor zwei Jahren Philip Kellers Mannschaft vor. Keller war maßgeblich an der Entwicklung des Digitally Scanned Light-Sheet-Mikroskops in Stelzers Gruppe beteiligt und leitet seit 2010 sein eigenes Labor am Janelia Research Campus des Howard Hughes Medical Instituts in der Nähe von Washington DC. Dort untersucht er mit dem LSM die Entwicklung von Nervensystemen in kleinen Modellorganismen wie Zebrafisch-Larven oder Maus-Embryos.
Dazu betten Kellers Mitarbeiter die Proben zumeist in Agar ein und bestrahlen sie mit einem sogenannten Multiview-DSLM, das die Lichtscheiben aus verschiedenen Winkeln auf die Organismen wirft.
Mit dem Multiview-DSLM lässt sich zwar die Auflösung in axialer Richtung erhöhen, einige optische Probleme, die nicht nur Kellers Gruppe das Leben bei der LSM schwer machen, bleiben jedoch weiterhin bestehen. So erschweren zum Beispiel die unterschiedlichen Brechungsindizes von Agar-Einbettung und Zellinnerem die exakte Ausrichtung der Lichtscheibe in der Fokusebene des Detektions-Objektivs. Das gleiche gilt auch für Zellbestandteile, etwa einzelne Kompartimente in den untersuchten Organismen, die unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen.
Um diese Probleme in den Griff zu bekommen, entwickelte Kellers Gruppe ein „smartes“ Lichtscheibenmikroskop. Gesteuert von entsprechenden Algorithmen reagiert dieses automatisch auf kleine Veränderungen der optischen Parameter, die insbesondere bei länger dauernden Live-Cell-Imaging-Versuchen auftreten.
Das DSLM ist hierzu mit Scannern ausgestattet, die kleine Abweichungen erkennen und an Piezo-Aktoren weitergeben. Diese passen das optische System durch Drehen der Probenhalterung sowie Verschieben von Illuminations- und Detektions-Objektiven in axialer Richtung an. Nach den Angaben der Gruppe verbessert sich die räumliche Auflösung und Signalstärke durch das Autopilot-System um das zwei- bis fünffache. Noch eins drauf setzte im April eine große Gruppe um Eric Betzig. Das Team integrierte die normalerweise von Astronomen in großen Weltraumteleskopen eingesetzte sogenannte Adaptive Optik (AO) in das Lattice-Light-Sheet-Mikroskop. Herausgekommen ist ein AO-LLS-Mikroskop, das nicht nur erstaunlich scharfe 3D-Bilder vom Zellinneren liefert, sondern auch spektakuläre Videoaufnahmen (Science 360: 284).
Die Lichtscheibe des LLS-Mikroskops entsteht durch die periodischen Interferenzmuster eines zweidimensionalen optischen Gitters (Lattice). Das optische Gitter ist nur einige hundert Nanometer dünn und verbreitet sich im Idealfall ohne Lichtbeugung in der Probe. Es dringt hierdurch tiefer ein und ist weniger phototoxisch als konventionelle Lichtscheiben.
Bildausschnitt aus einem Video, das die Neuronen im Gehirn eines lebenden Zebrafisch-Embryos zeigt. Die Bilder des Videos wurden mit einem Mikroskop mit Adaptiver Optik aufgenommen. Foto: Labor Eric Betzig
Mit zunehmender Eindringtiefe treten aber auch bei der LLS-Mikroskopie sowohl im Anregungs- wie auch im Detektionsstrahlengang Abbildungsfehler (Aberrationen) auf, die von der Probe verursacht werden. Im AO-LLS-Mikroskop werden diese auf beiden Seiten durch eine Adaptive Optik korrigiert. Als optische Referenz für die AO dient ein durch Zwei-Photonen-Anregung (TPEF) erzeugter fluoreszierender Abschnitt in der Probe, der in Anlehnung an die ursprünglich für die Astronomie entwickelte AO, als Leitstern (Guide Star) bezeichnet wird.
Auf der Detektionsseite befindet sich der Leitstern zum Beispiel in der Fokusebene des Detektions-Objektivs. Die von ihm ausgesandten Fluoreszenzsignale werden an einen sogenannten Shack-Hartmann-Wellenfront-Sensor übertragen, der die darin enthaltenen optischen Aberrationen misst. Anhand der Messdaten erzeugt ein verformbarer Spiegel innerhalb des Detektionsstrahlengangs schließlich genau die umgekehrten Aberrationen und gleicht hierdurch Abbildungsfehler aus. Ganz ähnlich verläuft auch die Korrektur auf der Anregungsseite.
Noch ist Betzigs AO-LLS-Prototyp auf einem gut drei Meter langen Arbeitstisch installiert und produziert riesige Rohdatenmengen, die erst mit viel Rechen- und Zeitaufwand in aussagekräftige Bilder umgewandelt werden müssen. Aber mal sehen wie lange es dauert, bis das erste kommerzielle AO-LLS-Mikroskop mit kompakten, laborgerechten Abmessungen auf den Markt kommt, das von einem simplen PC gesteuert wird.
Bis es soweit ist, können Sie sich mit einem der zahlreichen Live-Cell-Imaging-Systeme auf den nächsten Seiten trösten, die bezahlbar sind, wenig Platz brauchen und ohne lange Rechnerei anständige Bilder liefern.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 07/2018, Stand: Juni 2018, alle Angaben ohne Gewähr)
