Mini-, Midi-, Maxi-, Mega- und Gigapräp: Plasmid-Isolations-Kits sind inzwischen in allen Größenordnungen erhältlich – und seit kurzem gibt es auch noch den Mirapräp.
Maxipräps erfordern einen deutlich höheren Material- und Zeitaufwand als Minipräps. Maxipräp-Ausbeuten mit Minipräp-Aufwand verspricht das Protokoll des Mirapräps.
Als die ersten Kits für die Isolation von Plasmiden vor ziemlich genau dreißig Jahren in biowissenschaftlichen Laboren auftauchten, war schnell klar, dass sie eine Erfolgsstory werden würden. Genervt von umständlichen und nicht besonders gesundheitsförderlichen, traditionellen Plasmid-Isolationsverfahren, stürzten sich Molekularbiologen mit Begeisterung auf die kleinen Pappschachteln, die alles enthielten, was sie für die schnelle, einfache und saubere Extraktion von Plasmid-DNA benötigten.
Ein Grund für den durchschlagenden Erfolg der Plasmid-Isolier-Bausätze war und ist, neben der Omnipräsenz Plasmid-basierter molekularbiologischer Methoden, ihr beinahe schon banaler und narrensicher zu handhabender Inhalt: ein Fläschchen mit Lysispuffer, eines mit Waschpuffer, wenn‘s hoch kommt noch ein Elutionspuffer (Wasser reicht auch) und natürlich der Goldesel der Kits – ein Satz Silica-Säulchen, an die die Plasmid-DNA bindet.
An diesen Basiskomponenten hat sich in den letzten dreißig Jahren nichts Wesentliches verändert. Die Hersteller haben die Puffer und das Säulenmaterial über die Jahre hinweg aber immer weiter verfeinert. Inzwischen dauern die meisten Protokolle nur noch eine knappe Viertelstunde und liefern fette Ausbeuten. Bei typischen Minipräps aus einigen Millilitern Bakterienkultur sind dies gut 25 Mikrogramm Plasmid-DNA, bei Maxipräps mit bis zu fünfhundert Millilitern Ausgangsmenge etwa das Zehnfache. Auch bei der Reinheit der isolierten Plasmid-DNA gibt es in der Regel nichts zu meckern.
Ulrich Nübel, der die am Leibniz Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) in Braunschweig angesiedelte Professur „Mikrobielle Genomforschung“ des Deutschen Zentrums für Infektionsforschung inne hat, wollte es trotzdem genauer wissen.
Zum Kerngeschäft seiner Mannschaft zählt die Extraktion von DNA aus Mikroorganismen und deren anschließende Sequenzierung für die Genomanalyse. Nübels Team stellte sich deshalb die berechtigte Frage, ob die Wahl des DNA-Extraktions-Kits einen Einfluss auf die anschließende Sequenzierung mit einem MiSeq-System hat (Becker et al., Scientific Reports 6:28063).
Als Versuchsobjekt wählte die Gruppe das Gram-negative Bakterium Klebsiella pneumoniae, das neben einem 5.278 Kilo-Basenpaaren (kb) langen Chromosom noch ein großes (362 kb) sowie zwei kleine (4,8 und 3,8 kb) Plasmide beherbergt. Die Extraktion der DNA führten die Braunschweiger mit sechs verschiedenen Kits durch: fünf davon Kits zur Isolation genomischer DNA, dazu noch ein Plasmid Minipräp-Kit. Die Kits kamen von drei verschiedenen Herstellern und deckten das übliche Methodenspektrum für die DNA-Isolation ab: Anionenaustausch-Säulen, magnetische Silica-Beads, Silica Spin-Säulen sowie Aussalzverfahren (zwei Kits).
Und wie sahen die Ergebnisse aus? So gut wie keine Unterschiede fand die Gruppe bei der reinen Bearbeitungszeit für die Extraktionsprotokolle (Hands-on-Time). Für drei Proben benötigten Nübels Mitarbeiter bei allen getesteten Kits zwischen einer halben und einer ganzen Stunde. Deutlich größer waren die Zeitunterschiede bis zur kompletten Fertigstellung der Extraktionen. Beim schnellsten Kit dauerte diese etwas mehr als zwei Stunden, beim langsamsten gut acht Stunden. Auch die Ausbeuten waren alles andere als einheitlich. Lässt man die Ausbeute des Plasmid Miniprep-Kits von 0,5 Mikrogramm einmal außen vor, so bewegten sich diese zwischen etwas mehr als drei und acht Mikrogramm.
Die Reinheit der extrahierten DNA beurteilten Nübel und Co. wie üblich anhand des Quotienten aus der bei 260 sowie 280 Nanometern gemessenen Absorption. Für die Erstellung einer brauchbaren DNA-Bibliothek für die MiSeq-Sequenzierung sollte dieser laut Hersteller zwischen 1,8 und 2,0 liegen. Streng genommen erfüllten nur zwei Kits dieses Kriterium, bei dreien lag der Wert knapp unter 1,8, bei einem Aussalzungs-Kit zeigte das Spektrometer ein ziemlich mieses A260/280-Verhältnis von 1,58 an.
Aus der extrahierten DNA stellte die Gruppe schließlich Sequenzierungs-Bibliotheken her und setzte diese für die MiSeq-Sequenzierung ein. Trotz der nicht gerade überragenden A260/280-Werte einiger Kits traten bei der Sequenzierung keine signifikanten Unterschiede bei der Länge der Reads oder der Sequenzabdeckung (Coverage) auf.
Aus allen Kits resultierten Coverage-Werte für das Chromosom und das große Plasmid, die auf eine dreißig- bis fünfzigfache Abdeckung schließen ließen. Die Abdeckung bei den zwei kleinen Plasmiden war jedoch um einige Größenordnungen höher. Ein Silica-basierter Kit erreichte hier zum Beispiel für das 3,8 kb Plasmid eine mehr als zweitausendfache Abdeckung. Aus der Reihe tanzten die zwei Aussalzungs-Kits, bei denen die Coverage-Werte für die zwei kleinen Plasmide durchgehend um einen Faktor sieben bis zwölf kleiner waren als die der Silica-basierten Kits. Nübels Gruppe vermutet, dass die verstärkte Bindung der kleinen Plasmide an die Silica-Matrices zu einer leichten Anreicherung in den DNA-Extrakten führt.
Kommen wir noch zum letzten, aber entscheidenden Unterschied der getesteten Kits: dem Preis. Um diesen vergleichen zu können, berechnete Nübels Gruppe die Kosten pro DNA-Extraktion der einzelnen Kits und kam auf 1,10 Euro bis 8,10 Euro. Das Fazit der Gruppe fällt entsprechend eindeutig aus: Wenn die unterschiedliche Abdeckung kleiner Plasmide für die Sequenzierung keine Rolle spielt, kann man die DNA-Extraktions-Kits getrost anhand des Preises, dem Zeitaufwand oder der Möglichkeit zur Automatisierung aussuchen.
Trotz der allgegenwärtigen Plasmid Extraktions-Kits verwenden viele Labore auch noch eigene Protokolle, die meist auf der alkalischen Lyse der Bakterienzellen und der anschließenden Fällung der freigesetzten DNA mit Alkohol basieren. Aber auch aus kommerziellen Kits lässt sich mit wenig Aufwand noch einiges herauskitzeln.
So präsentierte die Karlsruherin Mira Pronobis, die derzeit ihren Post-doc im Labor von Mark Pfeifer an der University North Carolina at Chapel Hill, USA, absolviert, ein Protokoll, das mit einem Minipräp-Kit Maxipräp-Ausbeuten liefert. Pronobis nennt dieses wundersame Plasmid-Isolations-Verfahren den Miracle- oder kurz Mirapräp (Pronobis et al., PLoS ONE 11(8):e0160509).
Pronobis gibt in ihrem Paper an, dass sie mit dem Mirapräp aus fünfzig Milliliter Bakterienkultur mit fünf parallel befüllten Minipräp-Säulchen im Schnitt 392 Mikrogramm DNA herausholt, obwohl die maximale DNA-Bindekapazität der Säulchen nur zwanzig bis fünfundzwanzig Mikrogramm beträgt. Und hierfür benötigt sie lediglich eine knappe halbe Stunde.
Wie schafft sie das? Pronobis Trick ist ziemlich simpel. Sie kombiniert die Alkoholfällung mit der Bindung der DNA an die Silica-Säulchen. Hierzu gibt sie nach alkalischer Zelllyse und Neutralisation des Zelllysats ein Volumenanteil reinen Ethanol auf den Überstand und trägt die hieraus resultierende Mischung portionsweise auf fünf Minipräp-Säulchen auf.
Offensichtlich führt die Ethanolfällung dazu, dass die Silica-Membran der Säulchen die DNA nicht nur durch physikalische Wechselwirkungen bindet. Sie wirkt gleichzeitig wie ein Filter, in dem sich die DNA-Klumpen verfangen. So erklärt sich zumindest Pronobis die hohe Plasmid-DNA Ausbeute ihrer Technik, die weit über dem liegt, was man anhand der reinen Säulenkapazität erwarten würde. Ein ausführliches Protokoll des Mirapräps finden Sie in den Supplements zum Pronobis-Paper.
Jede Menge kommerzieller Kits, die man mit dem Mirapräp-Protokoll aufpeppen kann, gibt es auf den nächsten Seiten.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 11/2016, Stand: Oktober 2016, alle Angaben ohne Gewähr)
