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Schnelle, einfache Emulsions-PCR

Jörn Glökler (TH Wildau), Ingo Fritz (Roboklon GmbH)


Roboklon GmbH
Kantstr. 65
10627 Berlin
Tel. +49 30 9489 2165

www.roboklon.com


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Abb. 1: Alles komplett: Das Micellula-Kit mit den benötigten Emulsionskomponenten plus optimierter DNA-Aufreinigung.
Emulsions-PCR wirkt gegen unerwünschte Artefakte und vermindert den PCR-“Bias“. Der Trick dabei:

Eine Emulsion unterteilt den Reaktionsraum in eine Vielzahl von kleinsten Kompartimenten, die jeweils nur eines oder wenige DNA-Moleküle enthalten. Die Komplexität der Wechselwirkungen unterschiedlicher Template-DNA-Moleküle wird, im Vergleich zu herkömmlicher PCR, um Größenordnungen reduziert.

Demgegenüber existiert in klassischen PCR-Reaktionen ein einziger, einheitlicher Reaktionsraum. Innerhalb dieses Reaktionsraumes können eine Unzahl zueinander ähnlicher DNA-Moleküle nahezu beliebig miteinander in Wechselwirkung treten. Das ist die Ursache für die Bildung von typischen, unerwünschten PCR-Artefakten wie Chimären oder Multimeren.

Bei geeigneter Verdünnung lässt sich weniger als ein Zielmolekül je Mizelle unterbringen (als „Mizellen“ werden hier Wasser in Öl-Tröpfchen bezeichnet; streng genommen handelt es sich um „reverse Mizellen“). So lässt sich bei komplexen Mischungen die Entstehung von Artefakten, Chimären, unspezifischen Banden und Kontaminationen weitgehend vermeiden. ePCR eignet sich besonders für die Amplifikation von hochkomplexen Nukleinsäurebanken in NGS oder auch für in vitro Evolution (z.B. SELEX). Besonders geeignet ist die ePCR für die parallele Einzelzellsequenzierung wie zum Beispiel die Kopplung von variablen Domänen der schweren und leichten Kette aus B-Zellen für die klonale Antikörpersequenzierung 1.

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Abb. 2: Beispiel für Bildung von PCR-Artefakten. Oben: Chimärenbildung, in herkömmlichen PCR-Reaktionen z.B. durch unvollständig kopierte Amplikons verursacht. Diese binden in Folgezyklen an ähnlichen, aber nicht identischen DNA-Molekülen und werden dort weiter verlängert. Unten: Mizellen schotten ähnliche Template-DNA-Moleküle räumlich voneinander ab und verhindern so die Chimärenblldung.
Voraussetzungen

Jede PCR-Reaktion benötigt, neben Enzymen, dNTPs und Puffer, immer ein passendes Primerpaar und eine DNA als Kopiervorlage („Template“). Wird eine PCR mittels Emulsion in zahlreiche kleinste Mikro-Reaktionskompartimente unterteilt, müssen sich, außer der Polymerase und dNTP, sowohl beide Primer als auch die passende Kopiervorlage innerhalb einer Mizelle befinden. Fehlen Primer oder DNA mit Bindungsstellen innerhalb einer Mizelle, findet innerhalb dieser Mizelle keine PCR-Amplifikation statt. Das Volumen solcher „leerer“ Mizellen kann nicht zur Ausbeute der ePCR-Reaktion beitragen.

Damit zeichnen sich interessante Anwendungsbereiche ab: Ideal geeignet ist die ePCR für die Amplifikation von Nukleinsäurefragmenten mit identischen Primer-Bindungsstellen. Beispiele sind etwa DNA-Bibliotheken („Libraries“) und PCR-Produkte, die re-amplifiziert werden sollen.

Ein konkretes Anwendungsbeispiel ist die PCR-Amplifikation von Oligonukleotid-Bibliotheken für SELEX. Entsprechende Bibliotheken bestehen aus zwei Primerbindungsstellen, die einen Bereich von mehreren Nukleotiden zufälliger Sequenz einrahmen. Beispielsweise können 40 Nukleotide mit zufälliger Sequenz in einer unkompartimentierten Reaktion nahezu beliebig miteinander wechselwirken. Bei einer herkömmlichen, unkompartimentierten PCR-Amplifikation ist die Bildung von unerwünschten Artefakten vorprogrammiert. ePCR führt hier zu deutlich besseren Amplifikationsergebnissen. In vielen Fällen macht ePCR erst die Regeneration von Selektionsbibliotheken mit hoher Ausbeute möglich.

Genomische DNA eignet sich als „Template“ für den Einsatz in Emulsion-PCR weniger gut: Im Verhältnis zur Gesamt-DNA Menge tragen nur wenige DNA Abschnitte passende Primerbindungsstellen. Es ist zwar möglich, eine ePCR ausgehend von genomischer DNA durchzuführen, aber gegebenenfalls sollte der Experimentleiter für solche Anwendungen eine zweistufige ePCR einplanen.

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Abb. 3: Die Emulsion wird vor der PCR in drei Reaktionsgefäße aufgeteilt. Vor der PCR wirkt die Emulsion noch ganz homogen, trüb-milchig …
Mikrofluidik des kleinen Mannes

Ein Ziel war es für uns, Emulsions-PCR verfügbar zu machen, ohne dafür spezielle, teure Gerätschaften zu kaufen. Wir haben ePCR auf den kleinsten Nenner reduziert und ein einfaches Protokoll entwickelt, das für viele Anwendungsbereiche mehr als ausreicht. Für die einfachste Form der ePCR wird die Emulsion durch Vortexen von der wässrigen Lösung und einem Öl mit Tensiden generiert. Nach der PCR in herkömmlichen Gefäßen und Geräten kann die entstandene DNA durch angepasste Aufreinigungskits direkt isoliert werden 2, 3. Auf der Basis unseres ursprünglichen Protokolls dazu ist sogar ein kommerziell erhältlicher Kit (Micellula DNA Emulsion & Purification Kit, Roboklon GmbH) entstanden. Aufgrund dieser sehr einfachen Umsetzung kann man diese Form der ePCR auch „Mikrofluidik des kleinen Mannes“ nennen, mit der man so manche Probleme auch ohne teurere Gerätschaften lösen kann.

Was dennoch häufiger schief geht

Zum Protokoll aus meiner ursprünglichen Publikation gab es häufiger Nachfragen hinsichtlich Probleme bei Enzymaktivität und in der konkreten Handhabung der Emulsion. Ein wichtiger Faktor ist vor allen Dingen die hydrophobe Grenzfläche der Tröpfchen, welche sich auf die Aktivität der Enzyme auswirken kann. Auch können in Puffern enthaltenen Tenside die Stabilität der Emulsion verringern – beispielsweise führen detergenzienhaltige PCR-Puffer zu Instabilität und zum Zusammenbrechen der Emulsion.

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Abb. 4: … aber nach der PCR segregieren größere Mizellen nach unten und sammeln sich am Boden des Gefäßes. Je nach Anwendung können die größeren Mizellen ebenfalls verwendet werden - für viele Anwendungen ist das völlig unproblematisch, so lange keine Artefaktbildung beobachtet wird. Alternativ verbleiben sie im Reaktionsgefäß und werden verworfen - das ist ggf. wichtig für einige diagnostische Anwendungen.
Hier nun ein paar Tipps:
Vortexen vs. Rühren

Die einfachste Möglichkeit, eine Emulsion herzustellen, ist die Verwendung eines Vortexers. Man kann spezielle Aufsätze für Mikrotiterplatten nutzen, um den Durchsatz zu erhöhen und seine Hand zu schonen. In größeren Ansätzen mag sich auch die tropfenweise Zugabe der wässrigen Phase in die Öl- und Tensidmischung unter Verwendung eines Magnetrührers eignen. Wichtig ist jedoch, dass die Bildung der Emulsion schnell erfolgt und/oder bei niedriger Temperatur (4 °C) umgesetzt wird, damit enzymatische Reaktionen erst danach in einzelnen Kompartimenten stattfinden können. Ein kleiner Tipp für den praktischen Einsatz: Platz ist in der kleinsten Hütte – wir haben Vortexer und Reaktionsgefäße kurzerhand in ein freies Fach eines Kühlschrankes geräumt – und uns damit den Gang in den Kühlraum gespart. Weiterhin sollte man beachten, dass eine Emulsion nicht eingefroren werden sollte, da Eiskristalle die Integrität der Mizellen auch zerstören können.

Sind meine Ansätze kompatibel?

Das Verhältnis von Grenzfläche zum Gesamtvolumen in einer Mizelle ist um viele Größenordnungen höher als in einer konventionellen Reaktion. Nach Murphy‘s Gesetz sind gerade die interessanten Enzyme, wie z.B. reverse Transkriptasen, in ihrer Aktivität eingeschränkt und daher nicht immer kompatibel mit Emulsionen. Ob das Wunschenzym mit Emulsionen kompatibel ist, lässt sich beim Hersteller erfragen, ansonsten hilft Ausprobieren. Ein mit dem oben erwähnten Micellula Kit kompatibler RT-PCR Master Mix findet sich hier.

Auch bringen viele der erhältlichen Enzyme und Puffer ihrerseits Tenside und andere Komponenten mit sich, welche oft auch nicht in der Inhaltsangabe auftauchen. Deshalb empfiehlt es sich, diese mittels Kontrollen vorher auf Aktivität zu testen und die Stabilität der Emulsion zu beobachten. In manchen Fällen hat sich die Zugabe von BSA bewährt um die Grenzflächen etwas abzublocken, jedoch kann das auch wieder enzymatische Reaktionen bei zu hoher Konzentration inhibieren. Auch wurde es schon mal beobachtet, dass manche Enzyme besser unter Rühren statt Vortexen in die Emulsion eingebracht werden können. Wenn möglich greift man besser auf bereits funktionierende Kombinationen zurück um sich so umständliche Optimierungen zu ersparen.

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Abb. 5: Emulsion unter dem Mikroskop: Die Größe der Tröpfchen fällt bei dieser Methode unterschiedlich aus und deren Volumina unterscheiden sich um mehrere Größenordnungen. Da allerdings die Anzahl der Tröpfchen sehr groß ist, wirkt die Statistik einem theoretisch denkbaren Bias entgegen.
Die verschiedenen Phasen einer Emulsion

Streng genommen gibt es keine stabile Emulsion, nur unterschiedlich schnelle Trennung der Phasen je nach Zusammensetzung und Größe der Mizellen. Das kann dazu führen, dass nach einer längeren PCR die zuvor milchige Emulsion zumindest teilweise (meistens am Boden des Gefäßes) aufgeklart ist. Das muss jedoch nicht heißen, dass keine getrennte Reaktion abgelaufen ist. Eine durchaus praktische Herangehensweise ist es daher, den klaren Teil der Reaktion zu verwerfen und nur den trüben Teil mit einer Pipette vorsichtig abzuheben und zum Aufbrechen der Emulsion und der weiteren DNA-Reinigung über die DNA-Bindungssäulen zu verwenden.

Um die Emulsion für die DNA-Reinigung aufzubrechen wird 2-Isobutanol verwendet. Nach dem Aufbrechen können sich manchmal 2 Phasen bilden, manchmal bildet sich auch nur eine einzige Phase heraus. Wichtig ist, darauf zu achten, dass die Flüssigkeit nach Aufbrechen der Emulsion transparent und klar ist. Ist die Flüssigkeit milchig, dann ist die Emulsion nicht vollständig aufgebrochen. Eventuell in Mizellen verbliebene DNA kann in der weiteren Aufreinigung nicht an die Säule gebunden werden und geht verloren, resultierend in verminderter / geringer DNA-Ausbeute.

DNA-Reinigung

Nach dem Aufbrechen gestaltet sich die weitere Aufreinigung erfreulich unspektakulär: Die DNA wird auf einer Säule gebunden, gewaschen und eluiert, wie üblich.

Trotz der optischen Ähnlichkeit sind die beiden Phasen der Emulsions-PCR nicht vergleichbar mit einer Phenol-/Chloroform-Extraktion. Nach Zugabe von Puffern zum Einstellen der optimalen DNA-Bindungsbedingungen auf der Säule reinigt man die gesamte Flüssigkeit über die Säule auf, also nicht lediglich eine von zwei Phasen.

Anschließend wird die Säule gewaschen und die gereinigte DNA von der Säule eluiert. Gereinigte DNA ist sofort bereit für den Einsatz in Downstream-Applikationen wie z.B. NGS. Einen guten Einstieg in die Methodik bietet das Manual des Micellula-Kits.

Was man sonst noch mit Emulsionen anstellen kann

Alles mögliche und vieles, was vorher nicht möglich war. Die einfache Integration in komplexeren enzymatischen Protokollen verbessert häufig das Ergebnis – nicht nur für ePCR, auch für andere molekularbiologische Assays. Interessant sind auch Anwendungen, bei denen zusammengehörige, aber nicht kovalent aneinander gebundene Moleküle in räumlicher Nähe zueinander verbleiben sollen z.B. separate mRNA-Moleküle, die eine funktionale Einheit bilden und zusammen per reverser Transkription in DNA überschrieben werden sollen. Es wurden bereits viele Anwendungen für biochemische Reaktionen in Emulsionen publiziert. Ein aktuelles Beispiel dafür könnte die Arbeit von Vvedenskaya und Nickels sein 4. Der Fantasie sind hier keine Grenzen gesetzt.

Literatur

1. Devulapally, P. R. et al. Simple paired heavy- and light-chain antibody repertoire sequencing using endoplasmic reticulum microsomes. Genome Medicine 10, 34 (2018).
2. Schütze, T. et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Anal. Biochem. 410, 155–157 (2011).
3. Schütze, T. & Glökler, J. Idiot-proof emulsion PCR. LabTimes 2010, 50 (2010).
4. Vvedenskaya, I. O. & Nickels, B. E. CapZyme-Seq: A 5′-RNA-Seq Method for Differential Detection and Quantitation of NAD-Capped and Uncapped 5′-Triphosphate RNA. STAR Protocols 1, 100002 (2020)



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Letzte Änderungen: 06.05.2021


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