Phasen und Phrasen

Isolierung von Membranproteinen

Hubert Rehm

Ganze Forschergenerationen haben sich die Zähne bei dem Versuch ausgebissen, Membranproteine von löslichen Proteinen zu trennen. Ob neue Methoden daran etwas ändern?

Der Schweizer Clement Bordier hatte als Postdok im Biozentrum Basel gefunden, dass man die Phasentrennung von Triton X-114 dazu nutzen könne, integrale Membranproteine von löslichen Proteinen zu trennen. Das Prinzip: Triton X-114 löst sich in wässrigen Puffern bei 0 °C, trennt sich jedoch bei Temperaturen über 22 °C, dem Wolkenpunkt, in zwei Phasen: Eine Triton X-114 reiche ölige untere Phase und eine Triton X-114 arme obere Phase. Bordier stellt in seinem Abstract fest: „Hydrophilic proteins are found exclusively in the aqueous phase, and integral membrane proteins with an amphiphilic nature are recovered in the detergent phase.” Als ich dies las, wurde Bordier mein Held – für eine Woche. Denn er ließ die Hoffnung keimen, ich könne damit auf einen Schlag, Membranproteine von Nicht-Membranproteinen trennen. Zudem imponierte es mir, dass Bordier ein fettes JBC-Paper ohne professoralen „Ehrenautor“ veröffentlicht hatte: Ein Mann mit Mumm! Im ersten Punkt wurde ich enttäuscht. Meine zwei integralen Membranproteine, das b-Bungarotoxin-Bindungsprotein und das synaptische Vesikelprotein Synaptophysin, tummelten sich keineswegs vollständig in der TX-114 reichen Phase, obwohl Synaptophysin vier Transmembrandomänen bei einem Molekulargewicht von nur 38 kD besitzt. Wahrscheinlich verteilten sich beide Proteine wegen ihrer hydrophilen Glykanketten zwischen den Phasen; der Reinigungseffekt war gering. Bordiers JBC-Paper verschwand in meinem Ordner „seltsame Methoden“.

Bordier erhielt dennoch ein Professur Associe in Genf und ist heute zudem Geschäftsführer von Bordier Affinity Products, einer Firma, die auf Antikörpern basierende Diagnostik-Kits verkauft. Mit der Phasentrennung scheint er sich nicht weiter beschäftigt zu haben. Dabei erschien die Methode weder theoretisch noch praktisch ausgereizt.

Dies hat nun ein Freund der Runkelrübe, Luis Gonzalez de la Vara, am Fuße der mexikanischen Aranda Berge nachgeholt und zu Ende gedacht.

Auch de la Vara stellt fest, dass sich Proteine, auch integrale Membranproteine, nicht ausschließlich in der einen oder anderen Triton X-114 Phase aufhalten, sondern in beiden, wenn auch in verschiedenen Konzentrationen. Die Verteilung gibt ihr Verteilungskoeffizient Ki wieder. Ki ist das Verhältnis der Konzentrationen eines Stoffes i in der oberen (Triton X-114 armen) zu der Konzentration in der unteren Phase. Hydrophobe Proteine besitzen demgemäß einen Ki < 1, hydrophile einen Ki > 1. De la Vara hat Rübenproteine mit Triton-X-114 „in Lösung gebracht“ (er zentrifugiert nur für 21 000g für zehn Minuten, siehe unten) und in einem manuellen Gegenstromverfahren zwischen den beiden Phasen verteilt. Das geht so: 1,5 ml Triton-X-114 Lösung werden in einem 2 ml Ep-cup P0 von 0 °C auf 25 °C erhitzt, und danach abzentrifugiert. Es entstehen 0,3 ml untere und 1,2 ml obere Phase. Die 1,2 ml obere Phase werden abgenommen und in ein Ep-cup P1 mit 0,3 ml frischer unterer Phase transferiert. Zu den 0,3 ml unterer Phase in P0 werden 1,2 ml frische obere Phase gegeben. Dann werden beide Ep-cups auf 0 °C gekühlt und gemischt. Anschließend werden beide wieder auf 25 °C erwärmt und abzentrifugiert. Ein Ep-cup P3 mit 0,3 ml frischer unterer Phase wird bereitgestellt. Die obere Phase aus P2 kommt in P3, die obere Phase aus P0 in P1 und in P0 werden wieder 1,2 ml frische obere Phase gegeben. Und so weiter und so fort. Die untere Phase in P0 wird so sukzessive mit frischer oberer Phase gewaschen, die erste obere Phase von P0 wird sukzessive mit frischer unterer Phase gewaschen. Macht man das n-Mal erhält man n+1 Fraktionen, zittrige Finger und die Proteine werden nach Maßgabe ihrer Hydrophobizität in einer Binominalverteilung über die Fraktionen verteilt. In P0 schwimmen die hydrophobsten in Pn die hydrophilsten Proteine. Die Amphiphilen bevorzugen die Zwischenfraktionen.

Mühsame Methode

Das ist schön und gut, in den Extrempositionen dürften sogar beachtliche Reinigungseffekte zu erwarten sein. Hier lassen sich die Proteine durch Zugabe von Puffer oder Triton-X-114 zudem konzentrieren. Aber für gewöhnlich hat man es mit Proteinen zu tun, die in den Zwischenfraktionen liegen. Deren Gipfel gleichen sanften Schwarzwaldhügeln, was kleine Ausbeute und geringe Reinigung bedeutet. Zudem gibt die Methode ein Maß der Hydrophobizität seines Proteins. Das allerdings gibt auch der Ki, den man schneller und einfacher erhält. Auch ist das manuelle Gegenstromverfahren arbeitsaufwändig und braucht Geschick. Sie müssen dutzende von Malen exakt die obere Phase von der unteren trennen: Ein Geduldsspiel für das de la Vara einen Preis verdient hätte. Übrigens: für die Reinigung extrem hydrophober Proteine reicht es, die erste Fraktion zehnmal mit frischer oberer Phase zu extrahieren. Schließlich goutieren nicht alle Proteine das n-malige Erhitzen und Abkühlen in Gegenwart von 3% (v/v) Triton X-114. So berichtet de la Vara, das die Aktivität der H+-ATPase verschwinde. Vielleicht hilft es, den Wolkenpunkt von Triton X-114 durch Zugabe von Triton X-45 zu senken (Ganong & Delmore, 1991). Weite Verbreitung dürfte der Methode dennoch nicht beschieden sein, es sei denn, es gelingt, sie zu automatisieren oder zu verstetigen. Man könnte sich eine Dünnschichtflussapparatur vorstellen, bei der über eine stationäre Triton X-114 reiche Phase bei 25°C eine Triton X-114 arme Phase fließt. Die Proteine eluieren dann nach Maßgabe ihrer Hydrophobizität: die hydrophilen zuerst. Eine Aufgabe für frustrationstolerante Tüftler.

Die Phasentrennung nach Bordier hat dennoch Liebhaber. So schreiben Thomas Arnold und Dirk Linke in einem Übersichtsartikel: „Phase separation is a simple, efficient, and cheap method to purify and concentrate detergent-solubilized membrane proteins.” Auch gebe ich zu, das meine pessimistischen Bemerkungen nicht für alle Biomoleküle gelten müssen. So wird in der Literatur über eine Pigmentbestimmung in Schweinefleisch mit der Triton X-114 Phasentrennung berichtet.

Wie auch immer: Wer Membranproteine trennen will, muss sie zuerst einmal in Lösung bekommen. Das ist ein Feld auf dem Schweiß und Tränen fließen. Mit nicht-denaturierenden Seifen gehen viele Membranproteine nicht in Lösung, mit SDS gehen sie zwar in Lösung, sind dann aber denaturiert, meist irreversibel. Das Problem schien bisher unlösbar. Im Februar 2008 hat Merck jedoch einen Kit (ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit) auf den Markt gebracht, von dem die Firma behauptet, er löse Membranproteine mit der Kraft von SDS und dennoch nativ. Wirkbestandteile des Kits sind die Reagenzien A und B. Sie wurden von dem Merck-Mitarbeiter Jörg von Hagen gefunden. Dies im Rahmen eines Screening-Programms von Mercks chemischer Bibliothek auf amphiphile Substanzen, wobei nicht nur Seifen, sondern alle wasserlöslichen Substanzen gescreent wurden. Messgröße war die Solubilisierung des Transmembranproteins EGF-Rezeptor im Vergleich zu Triton X-100.

Nach einem Merck-Artikel in der Zeitschrift Innovations (Nr. 28, Juli 2008) löse das Reagenz A zwei Membranproteine mit sieben Transmembraneinheiten besser als SDS. Reagenz B gäbe auch eine höhere Aktivität der über einen Glykosyl-Phosphatidylinositol-Anker mit der Membran verbundenen alkalischen Phosphatase wie Triton X-100. Bei genauem Hinschauen tauchen allerdings Fragen auf. Nach ihrem Innovations-Artikel haben Uwe Michelsen, der Produktmanager für ProteoExtrakt, und Jörg von Hagen ihre Extrakte nur für 15 Minuten bei 16 000 g abzentrifugiert. Es scheint von den Aranda Bergen (siehe oben) bis zum Odenwald Mode zu sein, derartige Extrakte als „solubilisiert“ zu bezeichnen. Jedoch: Unter diesen Bedingungen sedimentieren fein verteilte Partikel nicht, es ist also unklar, ob ProteoExtrakt wirklich besser solubilisiert oder nur besser suspendiert. Meine Nachfrage bei Herrn Michelsen ergab, dass anscheinend nie bei 100 000 g für eine Stunde abzentrifugiert wurde, wobei selbst das kein absolut sicheres Solubilisierungskriterium wäre (siehe Experimentator 5. Auflage, Abschn. 3.2.1).


Zweifel bleiben bestehen

Des weiteren zeigen Michelsen und von Hagen die Extraktionskraft von ProteoExtrakt nur für drei Proteine. Angaben über die Gesamtextraktion von Proteinen aus Membranen fehlen und wurden nach Michelsen auch nie durchgeführt.

Das größte Rätsel ist die Natur der Wundersubstanzen, Reagenz A und B. In dem erwähnten Innovations-Artikel wird beteuert, A und B seien keine Detergenzien und verträglich mit den meisten Proteinanalysemethoden, insbesondere der 2D-Elektrophorese. Uwe Michelsen teilte auf Nachfrage mit, es handele sich um wasserlösliche amphiphile Substanzen, über deren Natur er aus patentrechtlichen Gründen keine Auskunft geben dürfe. Auch, ob die Substanzen ionischer Natur sind, wollte er nicht mitteilen. Was soll man davon halten?

Es ist natürlich möglich, dass es Substanzen gibt, die besser als SDS solubilisieren und dennoch die native Konformation der Membranproteine erhalten. Zumindest hoffe ich das. Dass allerdings die Merckschen Produkte dieses Wunder vollbringen, halte ich nicht für nachgewiesen. Da Herr Michelsen mir versichert hat, ProteoExtract sei ein Verkaufserfolg, müssten einige Forscher darüber Auskunft geben können. Melden Sie sich! Wir sind gerne bereit, Ihre Erfahrungen mit Proteo­Extract zu veröffentlichen.


Letzte Änderungen: 04.05.2009