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Wiederauferstehung von den Toten

Renaturierung von Proteinen

Hubert Rehm


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Spiegelei

Die ultimative Aufgabe für den Proteinrenaturierer: Spiegeleier „entbraten“.

Wenn Proteine denaturiert sind, ist meist Hopfen und Malz verloren. Manchmal hilft aber auch ein Wiederbelebungsversuch mit der aus (Malz)Stärke gewonnenen Renaturierungshilfe b-Cyclodextrin.

Es gibt noch einige Fragen in der Biochemie, deren Beantwortung mit einem Nobelpreis belohnt würde. „Wie berechnet man aus der Aminosäuresequenz die Konformation eines Proteins?“ wäre eine solche Frage und damit zusammenhängend: „Unter welchen Bedingungen bildet sich aus einer denaturierten Aminosäurekette das native Protein?“

Für Antworten auf die zweite Frage ist man immer noch auf Serienexperimente nach dem Versuch-Irrtum-Prinzip angewiesen. Dabei stellt sich das Problem oft: So wird bei der Proteinüberexpression in Bakterien das produzierte Protein häufig denaturiert und flockt zu Inklusionskörpern aus, die aufgelöst werden müssen. Meist verwendet man dazu denaturierende Agenzien wie Harnstoff oder Guanidinium­chlorid oder SDS.

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Gegen die Verfilzung

Wie also haucht man Proteinleichen wieder Leben ein? Es gibt mehrere Hürden vor einer erfolgreichen Rekonstitution. Die erste ist, die Aggregation der Aminosäureketten zu verhindern: Sind die Stränge einmal verfilzt, können Sie einen Hut daraus pressen, aber es wird kein Doktorhut werden. Das Aggregationsproblem versuchten Charles Epstein und Christian Anfinsen schon in den 60er-Jahren des letzten Jahrhunderts durch Immobilisierung zu lösen. Sie banden die denaturierten Proteinmoleküle an eine Matrix, entfernten das denaturierende Agens und lösten das (hoffentlich renaturierte) Protein dann wieder ab. Die Idee: Das denaturierende Agens, zum Beispiel SDS, Harnstoff oder Guanidiniumchlorid, entfaltet die Proteinketten zwar, verhindert aber auch ihre Aggregation. Kritisch wird es erst, wenn das denaturierende Agens entfernt wird: Dann – so jedenfalls die Idee – können die Aminosäureketten miteinander verfilzen. Ist jedoch das denaturierte Protein an eine Matrix gebunden, kann es nicht mit seinesgleichen wechselwirken, also auch nicht aggregieren. Die Idee ist gut, funktioniert aber nicht immer. Manchmal lässt sich das Protein nicht mehr von der Matrix ablösen. Auch muss sich die Aminosäurekette nicht zwangsläufig wieder richtig zurückfalten. Faltet sie sich falsch zurück, kann es auch nach dem Ablösen von der Matrix zur Aggregation kommen – und selbst wenn nicht: Proteinleichen sind tot. Zudem ist die Methode umständlich. Glücklich scheinen mit ihr denn auch nur die Erfinder geworden zu sein. Anfinsen erhielt 1972 den Nobelpreis, (Titel seiner Nobelpreisrede: „Studies on the principles that govern the folding of protein chains”). Epstein dagegen verließ das Gebiet und entwickelte eine Trisomie 16-Maus als Modell für das Down Syndrom.

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Einfacher wäre es, in Lösung ohne Matrix zu renaturieren. Eine allgemeingültige und zuverlässige Vorschrift dazu gibt es (noch) nicht, doch sind einige Regeln bekannt. Zuerst gilt es einen einfachen Test zu entwickeln, der Ihnen sagt, ob das Protein in nativer Konformation oder denaturiert vorliegt. Bei Enzymen bietet sich die Enzymaktivität an, bei anderen Proteinen die spezifische Bindung eines Liganden.

Der Erfolg einer Renaturierung hängt dann ab von (mit Dank an einen gewissen Nikolai aus dem Netz):
  • der Zusammensetzung und pH-Wert des Renaturierungspuffers. Dies ist ein weites Feld: endlos können Sie Ionen, Ionenstärke, Cofaktoren, Thiol-Verbindungen und den pH-Wert variieren. Hier lohnt es sich, systematisch mit Mikrotiterplatten zu arbeiten und auf einen Schlag hunderte von verschiedenen Puffern zu testen. Anderenfalls verbraten Sie Jahre mit der Suche nach einem Renaturierungspuffer.
  • der Geschwindigkeit, mit der das denaturierte Protein in den Renaturierungspuffer überführt wird. Faustregel: Je schneller das denaturierende Agens, zum Beispiel SDS, entfernt oder unwirksam gemacht wird, desto besser der Renaturierungserfolg.
  • der Reinheit des zu renaturierenden Proteins. Verunreinigungen behindern die Renaturierung.
  • der Konzentration des zu renaturierenden Proteins. Faustregel: Je verdünnter desto besser. In verdünnten Lösungen können sich die Aminosäureketten beim Zurückfalten nicht gegenseitig stören. Intramolekulare Wechselwirkungen überwiegen die intermolekularen Wechselwirkungen.
  • der Zahl und Anordnung von SH-Gruppen. Faustregel: Je mehr SH-Gruppen ein Protein besitzt, desto unwahrscheinlicher ist eine korrekte Zurückfaltung respektive die Ausbildung der richtigen Disulfidbrücken. Eine Mischung von reduziertem und oxidiertem Glutathion bei basischem pH-Wert (8 oder höher) soll helfen, wobei das optimale Verhältnis von reduziertem und oxidiertem Glutathion für jedes Protein bestimmt werden muss. Manchmal bilden sich die korrekten Disulfidbrücken auch ohne die Zugabe von Thiol-Verbindungen (Marston et al., 1984 Biotechnol. 2, 800-804).

Das Wichtigste ist natürlich: Das denaturierende Agens muss beim Wechsel in den Renaturierungspuffer verschwinden.
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SDS beispielsweise sollte wenigstens auf Konzentrationen unterhalb seiner kritischen mizellären Konzentration sinken. Das ist jene Seifenkonzentration, unterhalb derer die Seife nur als Monomer und nicht mehr in Mizellen vorliegt. Bei SDS liegt die kritische mizelläre Konzentration bei 8 mM.

Der EXPERIMENTATOR Proteinbiochemie zählt fünf Methoden auf, die SDS-Konzentration einer Lösung herabzusetzen: Verdünnen, Dialyse, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie und Ausfällen mit K+ oder divalenten Kationen. Die Methoden sind in punkto Renaturierungserfolg nicht gleichwertig. Verdünnen beispielsweise geht schneller als dialysieren, und ist daher vorzuziehen, zumal auch das Verdünnen per se die Rekonstitution begünstigt. Ausfällen des SDS mit K+ oder divalenten Kationen läuft zwar auch schnell ab, doch besteht hier die Gefahr einer Adsorption der Proteine an das Präzipitat: Nach den Erfahrungen des Autors fehlt hinterher im Überstand sowohl das SDS als auch das Protein.


Rettungsring für Proteine

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Ein weiteres Renaturierungshilfsmittel für SDS-denaturierte Proteine wurde 1995 von David Rozema und Samuel Gellman beschrieben: β-Cyclodextrin. Es handelt sich um ein ringförmiges Oligosaccharid aus sieben α-1,4-glykosidisch verknüpften Glucosemolekülen und entsteht beim Abbau von Stärke. β-Cyclodextrin ist stabil in alkalischen Lösungen. Es besitzt einen hydrophoben Hohlraum und bildet mit SDS und anderen Seifen eine reversible, nichtkovalente, wasserlösliche Einschlussverbindung. Seine renaturierende Wirkung kommt also durch die schnelle und schonende effektive Entfernung von SDS zustande. So gelang es Rozema und Gellman 1996, mit Hilfe von β-Cyclodextrin denaturierte Carboanhydrase zu renaturieren.

Die Autoren vertraten dabei die Ansicht, es sei essentiell, das Protein während der Denaturierung (bei Hitzedenaturierung) oder hinterher (bei Denaturierung durch 5M Guanidiniumchlorid) durch Detergenzzusatz vor dem Aggregieren zu bewahren. Nach Rozema und Gellman hätten die Detergenzien eine Art Chap­erone-Wirkung. Dennoch sollte man die Lösung soweit wie möglich verdünnen (auf 10 - 50 µg/ml). Je nach Art der Denaturierung (Hitze oder Guanidiniumchlorid) erhielten die Autoren in Anwesenheit von SDS und nachfolgender Gabe von b-Cyclodextrin zwischen 15 und 28 Prozent der ursprünglichen Aktivität. Beim Denaturieren in Gegenwart von Cetyltrimethylammonium bromide waren die Ausbeuten höher: 81 respective 74 Prozent. Nicht­ionische Detergenzien erwiesen sich als wenig wirksam.

Die Methode funktioniert nach Gellman und Rozema nicht nur mit Carboanhydrase, sondern auch mit anderen Enzymen wie der dimeren Citrat-Synthetase. Sie funktioniert auch nicht nur in Lösung, sondern auch in SDS-Gelen. So hat Etsushi Yamamoto kürzlich α-Gluconidase aus Hefe mit Hilfe von β-Cyclodextrin im SDS-Gel wiederbelebt. Die α-Gluconidase Probe war für zwei Minuten mit Mercaptoethanol gekocht und auf ein 10 Prozent Lämmli-SDS-Gel aufgetragen worden. Nach dem Lauf wurde das Gel entlang der Laufrichtung in Streifen geschnitten und die Streifen bei Raumtemperatur für 30 Minuten in verschiedenen Renaturierungspuffern inkubiert (10 mM Na-Phosphat Puffer pH 7,6 mit verschiedenen Konzentrationen β-Cyclodextrin (0 -1,5%) oder Triton oder Isopropanol).

Alle Streifen wurden zum Schluss für fünf Minuten in 10 mM Na-Phosphat Puffer pH 7,6 inkubiert und danach mit dem α-Gluconidase-Substrat p-Nitrophenyl-α-D-Glucopyranosid in Phosphatpuffer inkubiert. Falls das Enzym in nativer Konformation vorliegt, also aktiv ist, entsteht das gelbe p-Nitrophenyl. Und tatsächlich: Ab einer Konzentration von 0,05 Prozent β-Cyclodextrin färbten sich die mit b-Cyclodextrin inkubierten Streifen nach zehn Minuten gelb und dies an der richtigen Position: bei 68 kDa, dem Molekulargewicht der a-Gluconidase.

Das Ergebnis verwundert. Denn einerseits wird das Enzym im Lämmli-Gel ja konzentriert was die Renaturierung behindern sollte, und andererseits dauert die Equilibrierung eines 10%igen Lämmli-Gels mit Puffer, also auch mit β-Cyclodextrin, etwa eine halbe Stunde: Von schneller Entfernung des Denaturierungsmittels kann also keine Rede sein. Vermutlich renaturieren nur die Enzymmoleküle an der Geloberfläche und die Ausbeute an renaturiertem Enzym ist dementsprechend niedrig. Dafür spricht, dass Yamamoto et al. keine Ausbeute angeben, obwohl das durchaus möglich gewesen wäre: Sie hätten die Banden aus den Gelstücken eluieren und mit nativem Enzym vergleichen können.








Letzte Änderungen: 04.05.2009


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