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Proteinexpression in Säugerzellen

Wer wohnt schon gern in Hochhäusern?

von Barbara Merkl


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Sich hoch arbeiten, endlich nach oben kommen – an manchen Instituten läuft das buchstäblich so: Die schnöde Arbeit im Keller, die Partys hingegen auf der Dachterrasse. Unsere Zellkultur-Autorin müht sich im Souterrain mit der extrazellulären Proteinexpression ab.

Gibt es Untersuchungen darüber, warum Zellkulturen und Tierställe meist in den Keller verbannt werden? Als ich meinen Chef darauf ansprach, wurde er rot und murmelte etwas von "gleich bleibenden Temperaturen". Meine Theorie ist, dass er und seine Kollegen die arbeitsintensiven Arbeiten aus ihrem Gesichtsfeld verbannen wollen. Sie wollen sich die Illusion erhalten, dass das Forscherleben ein leichtes, luftiges sei. Deswegen feiern wir unsere Labor-Partys auch für alle sichtbar auf der Dachterrasse. Aber zur Sache.

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Die Sache besteht aus Plastik und nennt sich Petrischale. Wir benützen sie, um darauf Säugerzellen anzusiedeln, die unsere extrazellulären rekombinanten Proteine exprimieren. Es handelt sich meistens um HEK293 EBNA-Zellen, manchmal benützen wir auch die Zelllinien Cos7, CHO- oder HT1080. Unser Ziel ist, daraus eine ordentliche Menge Protein zu isolieren. Das ist ein schweißtreibendes Geschäft und in folgenden beschreibe ich unsere Mühen, die Ausbeute zu optimieren. Wir haben die Zellen in verschiedenen Systemen kultiviert. Verglichen wurden der Arbeitsaufwand, der Preis und die gewonnene Menge Protein.

Ursprünglich züchteten wir die Zellen in 140 mm-Petrischalen. Nun ist es bei Zellen nicht anders als bei Menschen. Eine hohe Dichte spornt zu Produktivität an. Also lasse ich die Zellen im Selektionsmedium richtig dicht werden, bevor ich ihnen das fetale Kälberserum (FCS) entziehe. Das FCS muß gründlich entfernt werden, denn selbst 0,5 % Rest-FCS im Medium geben bei der Coomassiefärbung noch eine fette BSA-Bande. Die schmiert über das Gel und überlagert andere Banden. Daher wasche ich die Platten mehrmals mit PBS, bevor ich FCS-freies Medium zugebe. Glauben Sie mir: Es lohnt sich. Schon wegen der leuchtenden Augen meines Chefs, wenn ich ihm ein gestochen scharfes Coomassie-Gel präsentiere, mit einem dicken blauen Fleck in der Mitte, der der Größe des gesuchten rekombinanten Proteins entspricht.
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Der Höhepunkt der Proteinproduktion kommt zwei Tage nach dem FCS-Entzug. Dann wird das erste FCS-freie – hoffentlich proteinhaltige – Medium abgenommen und die Zellen wieder mit neuem FCS-freiem Medium versorgt. Das Waschen der Platten entfällt. Nach zwei Tagen wird wieder geerntet. Dieses Spielchen lässt sich fast endlos wiederholen. Tatsächlich gibt es Arbeitsgruppen, die das FCS-freie Medium bis zu 15-mal erneuern. Bei unseren rekombinanten Proteinen nimmt die Menge meist nach dem sechsten FCS-Wechsel ab. Es kommt zu einer Produktivitätskrise, wie sie ja auch beim Forscher regelmäßig auftritt. Sie sollten also gelegentlich prüfen, ob im Überstand noch Protein vorhanden ist.

Auf diese Art und Weise haben wir jahrelang unsere rekombinanten Spielzeuge hergestellt. Zum Glück geben sich richtige Chefs nicht mit einer funktionierenden Methode zufrieden. Sie suchen immer nach Veränderungen und Verbesserungen. So kam im Rahmen unseres "Zellkultur-Verlegungs-Projekts" mein Chef eines Morgens mit "Triple Flasks" von Nunc ins Labor. Als er sie mir überreichte, leuchteten seine Augen – fast so intensiv wie die blauen Flecken auf dem Coomassie-Gel.


Drei Stockwerke in der Flasche

Die Flaschen haben drei Stockwerke (wie schon der Name sagt) und eine Oberfläche von 500 cm2 bei einer Befüllung mit 150 ml Medium. Zum Vergleich: Eine 140 mm-Platte entspricht 145 cm2 und wird mit 20 ml befüllt. Bei Triple Flasks liegt das exprimierte Protein also wesentlich verdünnter vor. Das kann bei schwacher Expression zu Nachweisproblemen führen.

Auch bei den Triple Flasks gilt: Die Platten dicht zuwachsen lassen, dann waschen und auf FCS-freies Medium setzen, dann ernten im Zweitages-Takt. Klingt gut, allein die bösen Tatsachen... Schon beim Waschen treten die ersten Probleme auf. Die Zellen scheinen die Triple Flasks nicht sehr zu mögen – sie lösen sich leicht ab. Wer wohnt schon gern in Hochhäusern? Hier heißt es, Überzeugungsarbeit zu leisten. Eine Möglichkeit ist, weniger zu Waschen und dafür die erste Ernte zu verwerfen. Man kann auch die Oberfläche mit Collagenlösung vorbehandeln und so die Zellen zum Bleiben überredet. Collagen wirkt vermutlich wie ein neuer Teppichboden auf unwillige Mieter. Ansonsten haben die Triple Flasks Vorteile. Da die Überstände gegossen werden, nicht pipettiert, spart man Zeit und Pipetten. So sind Triple Flasks zwar teurer als einfache Zellkulturplatten, wenn man Zeit- und Müllersparnis berechnet, lohnen sie sich trotzdem. Endlich mal wieder ein Erfolgserlebnis für meinen Chef!

Auf diese Weise angespornt, kam er zwei Wochen später mit der nächsten Idee und Kaffeetasse ins Labor. Ohne letztere geht's bei ihm nicht. Was mich auf die Frage bringt, warum Chefs ihre Ideen immer mit der Kaffeetasse in der Hand vortragen. Haben sie Angst einzuschlafen oder wollen sie wenigstens damit etwas Handfestes präsentieren? Ich schweife schon wieder ab.


Sollen sie doch schwimmen!

Seine Idee war, unsere adherenten Zellen, die sich in den Triple Flasks gerne ablösen und im Konditionsschwimmen üben, in Suspensionskultur zu züchten. "Wenn sie schwimmen wollen, dann sollen sie doch schwimmen!" Für Suspensionskulturen nutzen wir ein Spinnerflaschensystem, wie es etwa von Integra Biosciences vertrieben wird. Also hinein mit den Dauerschwimmern. Und siehe da: Die eigentlich adherenten Zellen fühlen sich pudelwohl. Sie bilden kleine Kugeln und lassen sich so fröhlich durch die Flasche wirbeln. Ähnlich Menschen können auch Zellen in Windeseile ihren Prinzipien untreu werden.

Natürlich musste ich meine bewährte Methode abändern. Ich starte am ersten Tag mit drei dicht gewachsenen 140 mm-Platten. Die werden trypsinisiert und in 125 ml Selektionsmedium in eine 500 ml-Spinnerflasche gesetzt. Am nächsten Tag wird der Inhalt auf 250 ml aufgefüllt und am dritten Tag werden die Zellen abzentrifugiert und in FCS-freiem Medium aufgenommen. Von nun an entnehme ich alle zwei Tage 200 ml Medium, zentrifugiere die Zellen ab und versorge sie mit neuem FCS-freiem Medium. Die Kulturen vertragen mindestens sechs Medienwechsel. Achtung: Die Zellen teilen sich auch ohne FCS munter weiter; nach zwei Wochen überwächst die Kultur und die Zellen sterben ab.


Spinner sind leicht zu handhaben

In Spinnerflaschen liegt das exprimierte Protein etwas verdünnter vor als mit Platten, jedoch konzentrierter als in Triple Flasks. Bestechend an den Spinnerflaschen ist der geringe Zeitaufwand: Sie lassen sich leicht und schnell handhaben. Abschreckend sind die hohen Anschaffungskosten. Außerdem sollte man motorisch ungeschickte Kollegen von Werkbank oder Spülbecken fernhalten. Glasflaschen und -klöppel sind nicht bruchsicher und eine achtlose Arbeitsweise treibt die Kosten kräftig in die Höhe.

Wir finden, dass Spinnerflaschen bezogen auf Arbeitsaufwand und Proteinernte am besten abschneiden. Wegen der hohen Anschaffungskosten lohnt sich das System jedoch nur für Labors, die Proteinexpression in großem Maßstab betreiben oder die Flaschen auch anderweitig nutzen können. Für Arbeitsgruppen, die nicht über die Zahl und Menge der exprimierten rekombinanten Proteine ins Guinessbuch der Rekorde kommen wollen, empfehle ich die Triple Flasks. Sie schneiden bezogen auf Preis und Arbeitsaufwand sehr gut ab. Störend sind nur die Adhäsionsprobleme. Auf die guten alten Platten greift man zurück, wenn das Protein bei der Ernte möglichst konzentriert vorliegen soll.

Vielleicht gibt es ja Leser, die Erfahrung mit ähnlich revolutionären Methoden zur Arbeitsminimierung in der Zellkultur gesammelt haben und jetzt schon auf der Dachterrasse forschen dürfen. Die mögen sich doch bitte bei Laborjournal (wk@laborjournal.de) melden. Denn zumindest in Köln scheint das eingangs Gesagte zu gelten: Je höher das Stockwerk, desto weniger muß gearbeitet werden.



Letzte Änderungen: 08.09.2004


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