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RNA unter dem RADAR - Reprogrammierbare ADAR-Sensoren

Andrea Pitzschke


(12.04.2022) Mit Reprogrammierbaren ADAR-Sensoren hat man Transkripte sofort auf dem Schirm, wenn sie in der Zelle auftauchen. Ihre sehr raffinierte Funktionsweise haben die Erfinder von RNA-Editoren abgekupfert.

Am Expressionsmuster einer Zelle ist zu erkennen, welcher Zelltyp vorliegt, wie alt die Zelle ist, welchen Stress sie gerade erlebt und wie ihr sonstiges Befinden ist. An das Profil gelangt man aber erst nach Aufschluss der Zelle und der RNA-Extraktion, was ihren Tod bedeutet. Besser wäre es, wenn die Zelle ihre Genaktivitäten zu Lebzeiten mitteilen könnte. Dafür existieren zwar Reporter-Systeme, doch die verraten nicht, was nach der Transkription tatsächlich passiert. Promotoren können noch so aktiv sein: Wenn die frisch synthetisierte mRNA sofort wieder abgebaut oder von kleinen RNAs blockiert wird, tut sich bei der Expression nichts. Die Aussagekraft von Reporter-Signalen wird dann im besten Fall überbewertet oder tendiert gegen null.

Jonathan S. Gootenbergs Team am Massachusetts Institute of Technology (MIT) und der Harvard University suchte nach einem anderen Weg, mit dem es in lebenden Zellen den aktuellen Transkript-Status abfragen könnte. Die Gruppe konzentrierte sich dabei auf das Enzym Adenosine Deaminase Acting on RNA (ADAR), das Forscher schon seit einigen Jahren für das RNA-Editing einsetzen.

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Beim sogenannten A-zu-I-Editing schleust man eine guideRNA (gRNA) in die Zellen ein, die mit dem Sequenzabschnitt einer endogenen RNA hybridisiert. Die gRNA enthält ein Cytosin (C), das mit einem gewünschten Adenin (A) der endogenen RNA eine Fehlpaarung eingeht. Dieser Mismatch führt zu einer kleinen Ausbeulung (Bubble) auf der doppelsträngigen RNA (dsRNA), die die ADAR auf den Plan ruft. Das Enzym korrigiert den Fehler, indem es Adenin zu Inosin desaminiert, das vom Ribosom als Guanin (G) gelesen und translatiert wird.

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Reprogrammierbare ADAR-Sensoren überwachen wie ein Radar die Expression angepeilter Transkripte. Illustration: N. Hanacek/NIST

Gootenbergs Mannschaft drehte den Spieß um und entwickelte daraus Reprogrammierbare ADAR-Sensoren (RADARS), die ein Signal übermitteln, sobald spezifische RNAs in dem überwachten Organismus auftauchen (bioRxiv doi: 10.1101/2022.01.26.477951v1). Als exogene guideRNA verwendete die Gruppe eine wenige dutzend Nukleotide lange Sequenz, die fast perfekt komplementär zum Zieltranskript ist. Im Abschnitt mit der Fehlpaarung sitzt in frame ein Stoppcodon, stromabwärts von diesem schließt sich die codierende Sequenz eines Reporter-Proteins an.

RADAR-Sensoren

Die RADAR-Sensoren schleust man direkt in die Zelle ein oder lässt sie ausgehend von einem entsprechenden DNA-Vektor von der zelleigenen RNA-Polymerase transkribieren. Als Transfektionskontrolle und zur Normalisierung dient ein separates Transkript beziehungsweise ein Konstrukt, das beispielsweise Luciferase codiert. Solange die Zelle das Zielgen nicht exprimiert, ist nur das Signal der Luciferase messbar. Sobald es aber auftaucht, hybridisiert die Ziel-mRNA mit der Guide-Sequenz des zugegebenen RADAR-Sensors. Anstelle des zum Cytosin der endogenen RNA passenden Guanins enthält die gRNA jedoch ein Adenin – und zwar direkt im Stoppcodon. Die endogene ADAR desaminiert Adenin zu Inosin, um die A-C-Fehlpaarung zu beheben. Hierdurch wandelt sie das Stoppcodon zu einem Codon um, das vom Ribosom translatiert wird, wodurch die Proteinsynthese des Reporter-Proteins bis zum Ende fortschreitet. Die Reporter-Signale tauchen also nur auf, wenn die exogene RNA mit einem Zieltranskript hybridisiert und die ADAR das Stoppcodon aufhebt.

Nachdem der grobe Rahmen für die Funktionsweise der RADAR-Sensoren stand, testete und optimierte das Team sie mithilfe von Cypridina- (CLuc) sowie Gaussia-Luciferase-Reportern (GLuc). Da die Reaktionsprodukte der beiden Luciferasen unterschiedliche Absorptionsmaxima aufweisen, konnten die Forscher die Signale getrennt erfassen. Als Modellsystem nutzten sie HEK293FT-Zellen, die sie mit drei Konstrukten transfizierten: einer konstitutiv exprimierten CLuc zur Normalisierung, dem jeweiligen RADAR-Sensor sowie der Ziel-RNA. Letztere braucht man für tatsächliche Analysen natürlich nicht. Sie diente hier in Form eines absichtlich fehlerhaften Fluoreszenzprotein-Konstrukts (iGFP oder iRFP) nur dazu, zwischen Zellen mit oder ohne Ziel-RNA zu unterscheiden. In Zellen mit exprimierter Ziel-RNA waren die Reporter-Signale (GLuc) um das Fünffache höher als in Zellen ohne Ziel-RNA. RNA-Sequenzierungen bestätigten, dass in diesen Proben ein RNA-Editing der Stoppcodons stattgefunden hatte.

Die fünffache Signalsteigerung erschien der Gruppe aber etwas zu dürftig. Sie vermutete, dass die ADAR damit überfordert war, sämtliche eingeführte dsRNA-Mismatches korrigieren zu müssen. Das Team unterstützte das zelleigene Enzym deshalb mit einer exogenen, auf Hochleistung getrimmten ADAR. Tatsächlich erhöhte sich die Signalstärke mit dieser um das 51-Fache. Richtig happy waren die Forscher dennoch nicht. Das System schien ein Leck zu haben, denn selbst Zellen ohne Zieltranskript leuchteten. Offenbar war die getunte ADAR etwas zu übereifrig und editierte ziemlich unspezifisch drauflos. Die US-Amerikaner fanden aber schließlich eine ADAR-Variante, die für drei von vier getesteten Transkripten geeignet war, ausreichend starke Signale lieferte und ein akzeptables Hintergrundsignal aufwies.

Längere gRNA ist effektiver

Offen war auch noch die Frage der optimalen gRNA-Länge der RADAR-Sensoren. Nüchtern betrachtet und mit Enzymkinetik im Hinterkopf würde man vermuten: Lange dsRNAs sind stabiler und die Wahrscheinlichkeit, dass eine ADAR rechtzeitig auf sie stößt und den A-zu-I-Austausch ausführt, ist größer. Das Team testete verschieden lange gRNAs, bei denen das vorzeitige Stoppcodon jeweils in der Mitte platziert war. Mit der kürzesten gRNA mit 51 Nukleotiden funktionierten die RADAR-Sensoren gut, mit der längsten mit 351 Nukleotiden noch wesentlich besser.

Könnten die langen gRNAs aber nicht ungewollt das Enzym Dicer der RNA-Interferenz (RNAi) induzieren, das die Zieltranskripte zerstückeln würde? Diese Furcht entkräftete die Gruppe mit qPCR-Analysen, die zeigten, dass die Zellen ähnliche Mengen der Zieltranskripte aufwiesen, unabhängig davon, ob sie exogene gRNA enthielten oder nicht. RNAi funktioniert nur mit kurzen RNAs, die RADAR-Sensoren hingegen vorzugsweise mit langen gRNAs.

Gootenbergs Team fielen aber noch weitere Verbesserungen ein. Warum beispielsweise nicht zwei Stoppcodons in der exogenen RNA unterbringen? Das würde Stoppcodon-Readthroughs verhindern, bei denen das Ribosom den Translations-Stopp überliest, und würde hierdurch das Hintergrundsignal minimieren. Dieser Trick funktionierte tatsächlich. Noch bessere Signalstärken erhielt die Gruppe mit einer schlaufenförmigen gRNA, die deutlich länger ist als die Ziel-RNA und in den nichtpassenden Abschnitten insgesamt sieben Schlaufen ausbildet.

Hitzeschock-Reporter

Mit dem optimierten Design waren die RADAR-Sensoren bereit für einen lebensnahen Test in Zellen. Ihre Aufgabe bestand darin, hitzebedingte Änderungen der Genexpression in HeLa-Zellen nachzuweisen. Hierfür transfizierten die US-Forscher die Zellen mit zwei RADAR-Sensoren, die auf die Hitzeschockproteine Hsp40 sowie Hsp70 abzielten. Nach einem Hitzestress tauchten in den Zellen wie erwartet erhöhte Reporter-Protein-Signale auf. Die hitzebedingte Aktivierung von Hsp70 und Hsp40 sowie deren Verhältnis zueinander ähnelten den Ergebnissen, die die Gruppe mit parallel durchgeführten qPCR-Analysen erhielt.

RADAR-Sensoren eignen sich aber nicht nur dazu, Änderungen der Genexpression zu verfolgen: Sie können auch verschiedene Zelltypen identifizieren. Dazu muss aber ein Zelltyp-spezifisches Transkript bekannt sein, etwa die mRNA des Serinprotease-Inhibitors SERPINA1, der nur in der Leberzelllinie HepG2 vorkommt. Tatsächlich detektierte ein entsprechender RADAR-Sensor das SERPINA1-Transkript nur in den HepG2-Zellen, nicht aber in HEK293- oder HeLa-Zellen.

Spätestens jetzt müssten Krebsforscher hellhörig werden. Die Crux bei der Therapie besteht ja meist darin, Krebszellen gezielt töten zu müssen und gleichzeitig den Rest am Leben zu erhalten. Wenn Zellen sich von anderen aufgrund einer RNA-Spezies unterscheiden lassen, und man diese aufspüren und zur Expression eines Reporter-Proteins veranlassen kann, dann müsste man doch nur... Genau, das Reporter-Protein gegen eines tauschen, dessen Aktivität die Zelle umbringt.

Therapeutisch relevant wäre dafür beispielsweise die induzierbare Caspase iCaspase-9. In Zellen, die das Interleukin IL6 exprimierten, hat es mit einem iCaspase-9-RADAR-Sensor gegen IL6-Transkripte jedenfalls schon funktioniert. Der durch iCaspase-9 ausgelöste Zelltod ereilte nur diese Zellen.