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Kreatives Spiel mit Barcodes - SARS-CoV-2-Diagnostik mit NGS

Mario Rembold


(10.03.2022) Die qPCR ist äußerst zuverlässig und erlaubt eine exakte Quantifizierung der Viruslast. Sie glänzt aber nicht gerade beim Probendurchsatz und stößt an ihre Grenzen, wenn die Probenzahl sehr groß wird. Könnten hier hochdurchsatzfähige NGS-basierte Techniken in die Bresche springen?.

Omikron bringt Deutschlands diagnostische PCR-Kapazitäten an ihre Grenzen. Die eigentlich vorgesehene Bestätigung eines positiven Schnelltests durch einen Nukleinsäure-Nachweis wurde innerhalb weniger Wochen zu einer Herausforderung, und kurz darauf für viele Getestete faktisch unmöglich. Die quantitative Real-Time-PCR (qPCR) hat sich aus guten Gründen zum Goldstandard in der Diagnostik gemausert: Während die DNA, beziehungsweise die zuvor durch reverse Transkription aus RNA erzeugte cDNA, amplifiziert wird, misst der qPCR-Cycler ein Fluoreszenzsignal. Die Änderung der Signalstärke tritt in eine exponentielle Phase ein und anhand des Kurvenverlaufs kann man auf die Kopienzahl im Ausgangsmaterial rückschließen. Die Quantifizierung ist nicht zuletzt deswegen so exakt, weil die einzelnen Zyklen durch die Temperaturschritte genau definiert sind und immer etwa zu einer Verdoppelung der Zielsequenz führen.

PCR-Kapazitäten lassen sich durch das Poolen von Proben schonen, etwa, indem die Proben einer ganzen Schulklasse zunächst in einem PCR-Durchlauf gecheckt werden. Ist der Befund positiv, wird der Pool aufgelöst. Dann muss jede Einzelprobe separat in den Thermocycler. Bei hohen Inzidenzen hat das Pooling aber den gegenteiligen Effekt und erhöht den Aufwand: Wenn in jeder Klasse mindestens ein positiver Schüler sitzt, dann spart man weder Zeit noch Reagenzien.

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Es existieren aber auch Nukleinsäure Nachweisverfahren, die bei gleichbleibender Temperatur ablaufen, wie zum Beispiel die Loop-mediated Isothermal Amplification oder kurz LAMP. Der Trick bei der LAMP ist, dass mehrere (meist sind es sechs) speziell aufeinander abgestimmte Primer während der Replikation zu einem Zwischenprodukt mit hantelförmigen Sekundärstrukturen führen. An diesen Schleifen ist die DNA einzelsträngig und leicht zugänglich für Primer sowie eine spezielle Polymerase, die durch ihre Strand-Displacement-Aktivität doppelsträngige Abschnitte beiseiteschiebt.

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Der hohe Durchsatz und die niedrigen Kosten machen das Next-Generation-Sequencing auch für die Viren- und Pathogendiagnostik interessant. Foto: Fraunhofer IGB

Temperaturänderungen entfallen, und mithilfe von Fluoreszenz-Markern an den Primern lässt sich die Amplifikation verfolgen. In gewissem Maß ist hierdurch auch eine Quantifizierung möglich. Im einfachsten Fall führt die LAMP zu einem Farbumschlag, der oft mit bloßem Auge sichtbar ist und in weniger als einer Stunde ein Ja-oder-Nein-Resultat liefert. Auch die Extraktion der RNA oder DNA ist in der Regel nicht notwendig – alles was man braucht, ist in den fertigen und mit Primern versehenen Reaktionspuffern enthalten. Darüber hinaus ist nur ein Heizblock nötig, der eine Temperatur von rund 65 Grad Celsius hält (siehe hierzu auch das Methoden-Spezial in LJ 11/2021 ab Seite 60; Link).

Zweckentfremdete NGS

Die isothermale Amplifikation mit der LAMP ist vor allem dort reizvoll, wo große diagnostische Labore fehlen. Für den Nachweis von SARS-CoV-2 oder anderen Pathogenen kann man aber auch Next-Generation-Sequencing-Geräte einsetzen, deren Charme im Hochdurchsatz liegt. Versieht man jede Probe mit einem für den Getesteten individuellen Barcode, so kann man für das Next-Generation-Sequencing (NGS) das gesamte Material blind zusammenwerfen und theoretisch hunderttausende Proben auf einen Streich analysieren. In diesem Fall zweckentfremdet man die Sequenzierung ein wenig, denn die eigentliche Sequenz ist nicht interessant. Es geht nur darum, ob ein Bruchstück des Virusgenoms mit bekannter Sequenz enthalten ist und welcher Barcode dazu gehört. Das kann man dann aus einer Textdatei auslesen. Ein sinnvolles Quantifizieren der individuellen Viruslast ist damit natürlich nicht möglich.

Um es vorwegzunehmen: Die LAMP wie auch NGS haben neben vielen Vorteilen auch Nachteile und können die qPCR (noch) nicht ersetzen, aber durchaus ergänzen. Fraglich ist aber, ob sie uns in der aktuellen Pandemie über Engpässe bei den qPCR-Kapazitäten hinweghelfen können.

Massentests nicht nötig

Pamela Moll, Head of Kit Development beim Wiener Biotech-Unternehmen Lexogen, hält flächendeckendes Testen und das Verfolgen jedes einzelnen Verdachtsfalls zum jetzigen Zeitpunkt sogar für obsolet. „Am Anfang der Pandemie war das wichtig, aber jetzt, wo es Impfstoffe gibt und auch die Omikron-Variante im Zusammenhang mit der relativ hohen Impfrate nur selten diese extrem schweren Verläufe hervorruft, braucht es diese massiven Teststrategien nicht mehr.“ LAMP-Assays als Alternative zur PCR sieht sie ebenfalls nicht als Allheilmittel. „Neben einer positiven und einer negativen Kontrolle brauchen Sie dann noch einzeln zu jedem Sample eine interne Kontrolle“, erklärt sie den Aufwand.

Dass die LAMP keinen Extraktionsschritt benötigt und so robust ist gegen Verunreinigungen, hat auch Nachteile, weiß ihre Kollegin und Produktmanagerin Yvonne Göpel: „Bei den isothermalen Methoden generiert man extrem viel Material, das sehr stabil ist. Man muss die Proben anschließend also rigoros vernichten, weil man sonst nachfolgende Samples kontaminieren kann, und dann wird alles positiv!“ Das betreffe den gesamten Arbeitsplatz, fährt Göpel fort. „Deshalb wird wirklich das ganze Labor hinterher mit DNA-vernichtenden Chemikalien geputzt!“

Hilfreich seien isothermale Verfahren wie die LAMP dort, wo keine Labore in erreichbarer Nähe sind. „Dann ist das ein Vorteil. Die Firma New England Biolabs hat deswegen RT-LAMP-Reagenzien an afrikanische Staaten gespendet“, erzählt Göpel. Für ein modern ausgestattetes Labor hält sie einen Umstieg auf isothermale Amplifikation aber nicht für sinnvoll.

Lexogen bietet derzeit keine diagnostischen Leistungen an, sondern ist auf Kits für den Einsatz in der Forschung spezialisiert, vor allem zur Extraktion und zum Nachweis von RNA. Ein Beispiel ist das SARS-CoV-2 ARTIC Panel für die Sequenzierung auf Illumina-Maschinen. „Das ARTIC-Konsortium ist ein Zusammenschluss verschiedener wissenschaftlicher Gruppen, um sämtliche Viren zu überwachen, die eventuell eine Pandemie auslösen können“, erklärt Göpel. „Es geht zum Beispiel darum, die Evolution dieser Viren nachzuverfolgen.“

Sehr viele Targets

Daher wurde auch für SARS-CoV-2 ein ARTIC-Kit entwickelt. Es enthält 2 x 98 verschiedene Primer-Paare, um Coronavirus-Sequenzen aus cDNA für die Sequenzierung anzureichern. Diese decken das gesamte Genom des Virus ab, wobei der zweite Satz Primer-Paare leicht versetzt ist, um wirklich die gesamte Sequenzinformation zu erfassen. „Ansonsten würde man neu entstandene Mutationen unter Umständen übersehen“ begründet Göpel. „Das Ganze ist daher recht kostspielig, weil es nicht bloß um zwei kleine Targets geht.“

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So sieht an der University of California in Los Angeles ein kostenloses „niederschwelliges“ Corona-Testangebot aus. Die abgegebenen Speichelproben werden mit dem Swab-Seq-Verfahren getestet. Foto: Denis Heady, UCLA

Das ARTIC-Kit wird deshalb nicht für den individuellen Nachweis einer Infektion eingesetzt, sondern um die Ausbreitung von Virus-Varianten zu beobachten. Eine Möglichkeit ist zum Beispiel das Screenen von Abwasserproben. „Wenn neue Mutationen auftauchen, kann es sein, dass Primer ausfallen“, ergänzt Moll. „Deswegen werden immer wieder neue Primer hinzugemischt, um auch neue Virus-Varianten abzudecken. Mittlerweile wurden vom ARTIC-Network bereits vier Primer-Updates publiziert.“

In den vergangenen zwei Jahren wurden von verschiedenen Gruppen aber auch ein gutes dutzend Methoden entwickelt, die NGS-Plattformen für den diagnostischen Nachweis von SARS-CoV-2 im Hochdurchsatz nutzen. Zu diesen zählt zum Beispiel die SwabSeq-Technik, die Valerie Arboledas Mannschaft an der University of California, Los Angeles, auf die Beine stellte. Arboledas Team testet mit Swab-Seq kostenlos die Angehörigen des Universitäts-Campus. Für andere Schulen oder Universitäten in Kalifornien kostet der Test 20 Dollar (Nat. Biomed. Eng. 5: 657-65). Weitere NGS-basierte Verfahren sind LAMPore vom Hersteller für Nanoporen-Sequenzierer Oxford Nanopore Technologies (J. Clin. Microbiol. 59: e03271-20), INSIGHT von Sarah Teichmanns und Andrew Bassetts Gruppen am Wellcome Sanger Institute in Cambridge (Sci. Adv. 7: eabe5054), SARseq von Luisa Cochellas und Ulrich Ellings Gruppen am Vienna BioCenter (Nat. Commun. 12: 3132) oder VarsVID von einem brasilianischen Team (Sci. Rep. 11: 7122).

Skalierbar, billig und sensitiv

Eine der jüngsten NGS-basierten Nachweisverfahren namens One-Seq präsentierten im vergangenen Jahr die Teams von George Church und Marc Kirschner an der Harvard Medical School in Boston (medRxiv, doi: 10.1101/2021.04.12.21253357). Das Manuskript der beiden ist zwar noch nicht in einem Peer-Review-Journal erschienen, das Büro für Technology Development der Universität Harvard preist die zum Patent angemeldete Technik aber schon jetzt für potenzielle Investoren an. Auf der Website des Büros ist zu lesen: „One-Seq is a novel diagnostic method with three key advantages: it is highly scalable, allowing a throughput of 100.000 - 1.000.000 tests per day in a single clinical lab, with a turn-around time of 7,5 - 15 hr; it is extremely cheap at scale, with an estimated amortized reagent cost of $3 per test and significantly reduced personnel costs.“ Und weiter heißt es: „One-Seq has sensitivity similar to that of the ,gold standard, method, RT-PCR.

Klingt fast zu gut, um wahr zu sein. Sollten sich die Zahlen aber tatsächlich im diagnostischen Laboralltag bewahrheiten, dürften sich die Risikokapitalgeber in Harvard bald die Klinke in die Hand geben.

Die Methode trägt den Namen One-Seq, weil in einem Schritt und ohne vorherige RNA-Exktraktion eine cDNA-Library erstellt wird. Der jeweiligen Patientenprobe wird ein Primer für die reverse Transkription zugegeben, der mit einem individuellen Barcode versehen ist. Anschließend werden die Proben in einem Tube weiterbehandelt.

Church und Kirschner sprechen in ihrem Manuskript von einer Pooling-before-Amplification-Strategie. Die PCR, die mit virusspezifischen Primern das Material anreichert, kann also auf den gesamten Pool angewendet werden. Optional ist bei dieser PCR ein weiterer Barcode auf dem Reverse-Primer möglich, der den gesamten „Batch“ kennzeichnet. Prinzipiell könnte man, etwa in einer Firma, denselben Satz Barcodes für die reverse Transkription einsetzen wie in einer anderen Einrichtung. Sofern das Material von beiden Orten bei der PCR unterschiedliche Batch-Barcodes erhält, lassen sich die Proben dennoch wieder eindeutig zuordnen. Das PCR-Produkt wird auf einer Illumina-Maschine sequenziert, auf der zehn Milliarden Reads möglich sind.

Alternativ kann man auch die LAMP nutzen, um das Probenmaterial direkt nach der Entnahme zu amplifizieren und mit einem Barcode zu versehen. Auch hier erfolgt der Nachweis via NGS. Wie bei One-Seq lässt sich jede Probe zuordnen, ohne bei einem positiven Signal alle Spender erneut testen zu müssen. Entwickelt wurde diese als LAMP-Seq (inzwischen LAMPseq geschrieben) bezeichnete Technologie von Jonathan Schmid-Burgks Gruppe an der Uniklinik Bonn in Zusammenarbeit mit Forschern aus den USA und Israel (Nat. Biotech. 39 (12): 1556-62).

„Es ist die Kombination von Sensitivität und Hochdurchsatz bei gleichzeitiger Nachvollziehbarkeit der individuellen Probe“, beschreibt Erstautorin Kerstin Ludwig vom Institut für Humangenetik der Uniklinik Bonn den Vorteil von LAMPseq gegenüber der qPCR. Gleichzeitig betont sie, dass die Technik die qPCR nicht ersetzen könne. „Wir sehen das als flächendeckenden Screening-Test dort, wo viele Menschen immer wieder zusammenkommen. Wer ein positives LAMPseq-Ergebnis hat, benötigt dennoch eine qPCR, denn das ist für die Diagnostik der absolute Standard. Diese kann aber mit der bereits genommenen Probe gemacht werden, sodass kein zweiter Abstrich nötig ist“, so Ludwig.

Nach der Amplifikation mittels LAMP erfolgt auch hier eine PCR, für die die Proben aber schon gepoolt sein dürfen. Mit ihr werden zwei weitere Barcodes zugefügt. „Diese PCR müssen wir ohnehin machen, um die Adapter für die Sequenzierung anzuhängen“, erläutert Ludwig diesen Schritt. „Eine hohe Skalierung lässt sich somit mit einer überschaubaren Anzahl an Barcodes realisieren.“

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Kerstin Ludwig von der Universität Bonn will qPCR-Tests mit der LAMPseq-Technik nicht ersetzen. Das NGS-basierte Verfahren könnte ihrer Meinung nach aber eine Alternative zu den häufig ungenauen Antigen-Tests sein. Foto: Uni Bonn
Pilotstudie an Bonner Uniklinik

Die Bonner setzten LAMPseq auch in Praxistests ein: „Wir haben bereits Pilotstudien mit insgesamt über 20.000 analysierten Proben durchgeführt, bei denen wir im Studien-Setting vor allem die vor- und nachgelagerte Logistik erprobt und optimiert haben“, so Ludwig. „Dabei haben wir Angestellte des Uniklinikums getestet. Zudem waren wir schon bei einer fleischverarbeitenden Firma sowie einer Förderschule. Das hat überall super geklappt“, freut sich Ludwig über diese Erfahrungen. „Das Gesundheitsamt der Stadt Bonn hat LAMPseq jetzt auch für das Uniklinikum als Teil des Hygienekonzepts bewilligt“, fährt Ludwig fort. Aktuell seien es Mitarbeiter der Zahnklinik, die per LAMPseq gescreent werden.

Zähes Zulassungsverfahren

Um die Methode zukünftig auch in der Breite anwenden zu können, hat das Team die LAMPSeq Diagnostics GmbH gegründet. Das Zulassungsverfahren sei aber zeitaufwendig und kostenintensiv. „Dies ist mit Sicherheit auch einer der Gründe, warum LAMP als SARS-CoV-2-Nachweismethode derzeit noch nicht so verfügbar ist.“ An NGS-Geräten mangele es hingegen nicht. „Die sind vorhanden. Aber neben der Zulassung besteht eine weitere Herausforderung natürlich darin, die Abläufe eines sehr etablierten und über die Jahre gewachsenen Systems auf den Sequenz-basierten Hochdurchsatz umzustellen. Das geht nicht von heute auf morgen, sondern bedarf entsprechender Vorbereitung.“

In der praktischen Anwendung ohne vorherige Extraktion und Anreicherung der RNA ist die LAMP etwas weniger sensitiv als die qPCR. Für LAMPseq geben die Autoren Ct-Werte von 30 bis 33 an, bei denen der Test noch zuverlässig anschlägt. Damit ist die Methode den aktuell verfügbaren Antigen-Schnelltests deutlich überlegen. Bekanntermaßen sind die Schnelltests von sehr unterschiedlicher Qualität und versagen häufig jenseits eines Ct-Werts von 25. „Diese Lücke können wir mit unserem Nukleinsäure-basierten Verfahren schließen“, blickt Ludwig in die Zukunft.

NGS-Sequenzierung und isothermale Amplifikation werden also die qPCR in der medizinischen Diagnostik nicht ersetzen, sie könnten aber Alternativen für die Schnelltests schaffen – gerade wenn es um präventive Screenings in Kitas, Schulen, Universitäten oder Betrieben geht. Man darf hoffen, dass die aktuelle Pandemie ihrem Ende entgegengeht und solche Screenings in naher Zukunft ohnehin nicht mehr so dringlich sind. Sinnvoll ist es aber, mit ihnen auf künftige Pandemien vorbereitet zu sein.

Und auch endemische Erreger können zu lokalen Ausbrüchen führen und an sensiblen Einrichtungen wie Pflegeheimen oder Kliniken zum Risiko werden. Zwar kann man bei einem Testsystem nicht einfach ein paar Primer für einen neuen Erreger tauschen, denn allein das Design der Barcodes kann zu unerwarteten Reaktionen führen, die die Amplifikation abbrechen lassen. Prinzipiell kann man die meisten Workflows der NGS-basierten Methoden jedoch vergleichsweise schnell an neue Erreger anpassen, auch wenn man dann um eine erneute sorgfältige Validierung nicht herumkommt.