(08.12.2020) Es gibt viele Möglichkeiten, Antikörper gegen ein Zielprotein herzustellen, eine davon ist der Ribosomen-Display. Viele Jahre wurde er wenig genutzt, in Zeiten von SARS-CoV-2 ist er jedoch aktueller denn je.
Spätestens seit Donald Trump gegen seine Corona-Infektion mit Antikörpern vorging, wird darüber diskutiert, wer welche SARS-CoV-2-Antikörper hat oder wann haben wird, wie sie wirken, und ob man sie als Diagnostikum oder als Therapeutikum nutzen kann.
Zu SARS-CoV-2-Antikörpern gibt es viele Publikationen. Zwei der Arbeiten entstanden unter Mitwirkung des Labors von Markus Seeger an der Universität Zürich. Seeger verwendete ein Display-Verfahren, bei dem man für die Herstellung der Antikörper keine Tiere benötigt, sondern nur Laborequipment. „Das Spike-Protein des Virus ist ein sehr gutes Antigen, man kann leicht Antikörper dagegen generieren. Mit unserer Methode haben wir innerhalb von drei Wochen hoch spezifische und effiziente Sybodies gegen die Rezeptorbindedomäne (RBD) des Spike-Proteins isoliert“, erklärt Seeger.
Sybodies sind keine klassischen oder Einzelketten-Antikörper, sondern synthetische Nanobodies. Letztere sind kleine und sehr stabile Antikörper von Kameliden (s. Laborjournal 4/2019: 32-37 Link). Von Sybodies ist die Rede, wenn diese Moleküle nicht aus immunisierten Tieren, sondern aus einer synthetischen Bibliothek gewonnen wurden. Solche Bibliotheken hatten die Forscher in Zürich vor Jahren generiert, um Sybodies gegen Membranproteine zu gewinnen.
Was ist das Besondere an den Membranproteinen – oder anders herum gefragt: Warum hat man sich die Mühe gemacht, eine synthetische Bibliothek anzulegen, statt eine Maus zu immunisieren? Seeger: „ Man kann gegen alle möglichen Epitope sehr gut Nanobodies aus immunisierten Alpakas oder Lamas generieren. Aber es gibt Moleküle, mit denen man mit dieser Strategie nicht ans Ziel kommt. Dazu gehören sehr konservierte Proteine, denn mit diesen kann man nicht immunisieren. Schwierig ist es auch, aus Tieren Antikörper gegen spezielle Konformationen eines Proteins oder gegen instabile Proteine zu gewinnen. Membranproteine sind außerhalb der Membran nicht stabil, deshalb haben wir auf synthetische Bibliotheken gesetzt.“
Display-Bibliotheken kennt man schon seit über zwanzig Jahren. Man kann eine Bibliothek entweder aus dem natürlichen Antikörper-Repertoire naiver, also nicht immunisierter Tiere gewinnen – oder man stellt Nanobodies synthetisch her, indem man, ausgehend von einer oder mehreren Bindersequenzen, die variablen Bereiche an ausgewählten Stellen zufällig mutieren lässt.
Die Milliarden und Abermilliarden verschiedenen Sequenzen für Binder lässt man von Phagen, Bakterien oder Hefen exprimieren oder in vitro von Ribosomen translatieren, testet sie auf ihre Bindungsfähigkeit und isoliert von positiven Klonen die jeweilige Nukleinsäuresequenz. Diese Methode funktioniert mit Nanobodies ebenso wie mit rekombinanten Bindern wie Affibodies, Anticalinen, Monobodies oder DARPins, die ganz andere Grundstrukturen haben als Immunoglobuline (J. Cell. Biol. 209: 633-44).
Seeger setzte auf Ribosomen-Display. Der Vorteil: Man muss keine Mikroorganismen transformieren. Dies ist der entscheidende limitierende Schritt bei den anderen drei Display-Technologien. Deshalb sind Ribosomen-Display-Bibliotheken etwa tausendmal diverser. „Man kann standardmäßig zehn hoch zwölf Varianten einer Bibliothek in einem Selektionsexperiment testen“, berichtet Seeger. Diese Technologie wurde bisher nicht besonders häufig eingesetzt, denn der Umgang mit dem In-vitro-Translations- und -Transkriptionssystem war lange Zeit ein bisschen tricky, da man Ribosomen isolieren und sehr komplexe Translations-Puffer herstellen musste. Aber seit ein paar Jahren kann man In-vitro-Translations Kits kaufen.
Das Prinzip des Ribosomen-Display ist genial einfach. Man lässt Sequenzen der Binder-Bibliothek in vitro transkribieren und von Ribosomen translatieren. Aber – und das ist der Clou – man blockiert die Abtrennung der mRNA von den fertigen Sybody-Molekülen. Indem man das Stoppcodon an den mRNAs einfach weglässt, verhindert man, dass die Release-Faktoren aktiv werden. Der Translationskomplex wird nicht zerstört: der fertig translatierte und gefaltete Binder und die dazu gehörige mRNA bleiben miteinander verbunden. Auf diese Weise kann die mRNA potenzieller Binder identifiziert, in cDNA umgeschrieben und für weitere Analysen beziehungsweise zur Produktion der Binder kloniert werden.
Weil es so schwierig ist, Binder für Membranproteine zu generieren, griffen Seeger und Kollegen tief in die molekularbiologische Trickkiste (eLife doi: 10.7554/eLife.34317). Sie untersuchten zunächst eine ganze Reihe reifer Nanobodies von Lamas und klassifizierten sie anhand der Struktur ihrer Epitope. Daraus entwickelten sie eine Art Gerüst für drei Klassen von Bindern: solche, die Epitope auf ebenen Oberflächen binden, sowie solche, die Epitope erkennen, die entweder wie Berge aus einem Protein herausragen oder wie Täler tief in einem Protein versteckt liegen. Auf Basis dieser Nanobody-Gerüste synthetisierten sie drei Bibliotheken und überließen die Sequenzen in den drei besonders variablen Regionen der Sybodies dem Zufall. Seeger: „Ziel dieser Strategie, die wir Structure-based Library Design nennen, war es, möglichst viele Epitope anhand ihrer Form zu adressieren.“
In die Entwicklung dieser Bibliotheken steckten die Forscher viel Zeit und Energie. Sie suchten beispielsweise systematisch nach den experimentellen Schritten, bei denen Diversität verlorengeht, um diese zu optimieren. Weil jede Display-Methode einem Selektions-Bias unterworfen ist, wechselten die Forscher nach einer Selektionsrunde Ribosomen-Display zum häufig verwendeten Phagen-Display für weitere zwei Selektionsrunden. Außerdem veränderten sie die Immobilisierung des Zielproteins, um auch auf dieser Ebene Schieflagen möglichst zu vermeiden. „Erst das Zusammenspiel dieser Display-Kaskade hat uns bei den Membranproteinen wirklich weitergebracht“, sagt Seeger.
Auch wenn sein Interesse nach wie vor Membranproteinen gilt, hat er sich doch ins Rennen um gute Binder für das Spike-Protein von SARS-CoV-2 geworfen. Seeger: „Die RBD dieses Proteins ist ein einfaches Epitop, wir hatten sehr schnell gute Sybodies.“
Was dabei aber wirklich interessant ist, sind die Resultate. Die Zürcher Bibliotheken wurden nämlich nicht nur von ihren Entwicklern, sondern auch von Forschern in Heidelberg und China gescreent. Jede Gruppe hatte nach den drei Display-Runden etwa hundert Kandidaten analysiert, aber in China waren es andere Moleküle als in Zürich und Heidelberg. Seeger: „Das hat mich wirklich sehr überrascht. Bisher haben aber auch noch keine zwei oder drei Labore dieselben Bibliotheken nach einem Epitop adressiert. Jetzt kann man sehen, wie divers die Bibliotheken sind.“
Das heißt: auch wenn man bei seinem Experiment keine Kandidaten findet, sollte man es ruhig nochmal probieren – vermutlich sind doch passende Binder in der Bibliothek enthalten, man hat sie nur noch nicht gefunden. Die besten Binder, die die Wissenschaftler in Zürich und Heidelberg publizierten, erkennen an der RBD benachbarte, teilweise überlappende Positionen (bioRxiv doi: 10.1101/2020.11.10.376822, Nature Comm. 11: 5588). Seegers Team hat zwei sehr affine Sybodies identifiziert, die gleichzeitig an die RBD binden können. Daraus haben sie einen bi-spezifischen Sybody gemacht.
Jeder der Sybodies hat neutralisierende Wirkung, schaltet das Virus also aus. Seeger wundert sich darüber nicht: „Auf der ganzen Welt wird ja nach Antikörpern gesucht. Und soweit ich weiß, hat bisher noch jede Forschungsgruppe, die eine Serie von RBD-Antikörpern analysiert hatte, einige identifiziert, welche neutralisierende Wirkung haben.“
Es gibt bereits zwei RBD-Binder, die ebenfalls über Ribosomen-Display aufgespürt wurden, von denen einer sich schon in klinischen Tests befindet. Diese wurden von der Schweizer Firma Molecular Partners isoliert. Es sind allerdings keine Sybodies, auch keine anderen Immunglobuline: Vielmehr basieren sie auf einer anderen, rekombinanten Struktur, einem sogenannten DARPin (Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 55: 489-511).
Ein DARPin ist ein 14 kDa kleines, künstliches, von Ankyrin-Repeat-Proteinen abgeleitetes Molekül, das wie Antikörper Protein-Epitope erkennen und binden kann. Es besteht aus mehreren (Repeat-)Einheiten, die man aus synthetischen Bibliotheken von mehr als zehn hoch zwölf Mitgliedern kombiniert und dabei weiter zu extrem hohen Affinitäten evolviert. Innerhalb der Motive kann man gezielt DNA-Sequenzen und damit die Bindungseigenschaften verändern. Das Molekül MP0420 (ensovibep), das nun in der klinischen Prüfung ist, besteht aus einer Kette von fünf DARPins, von denen gleich drei gemeinsam die RBD des Spike-Proteins binden und die zwei übrigen dem Protein eine sehr lange Serum-Halbwertszeit geben.
Der geistige Vater sowohl der DARPin Technologie als auch des Ribosomen-Displays (PNAS 94: 4937-42) ist Andreas Plückthun, der ebenfalls an der Universität Zürich arbeitet und auch Molecular Partners mitgegründet hat. Er berichtet: „DARPin-Binder gegen SARS-CoV-2-RBD wurden ganz schnell entwickelt. Damit haben wir nun eine Art Handlungsanweisung gefunden, wie man auch in Zukunft vorgehen sollte, wenn sich beispielsweise SARS-CoV-2 verändert oder wir es mit einem neuen Virus zu tun bekommen. DARPins haben den großen Vorteil, dass man die Produktion vom Labor zum Fermenter sehr einfach upscalen kann. Sie lassen sich extrem einfach und kostengünstig großtechnisch in E. coli herstellen, und mehrere DARPins sind ja schon jetzt in der Klinik erfolgreich.“
Plückthun erklärt, dass MP0420 im November 2020 in klinische Studien ging, und eine Partnerschaft mit Novartis dafür in die Wege geleitet wurde. „Die klinischen Versuche müssen nun zeigen, ob man das Produkt am besten zur Linderung bei schweren Verläufen einsetzt, oder zur passiven Immunisierung bei Infizierten mit nicht ganz so heftigen Symptomen – oder auch zur Prävention bei älteren Menschen.“
Wir werden sicherlich in nicht allzu ferner Zukunft lesen können, welche neutralisierenden Antikörper oder Binder mit anderen Rückgratstrukturen zum Einsatz kommen.