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Biochemische Routinemethoden

Ratatouille mit Fisch

von Hubert Rehm


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Beim Ratatouille handelt es sich um einen fanzösischen Gemüseeintopf: Alles mögliche zusammenschnitzeln, im eigenen Saft schmoren lassen und kräftig würzen. Nach diesem Rezept wurde im folgenden Artikel vorgegangen. Einige der zitierten Autoren sind auch französischen Ursprungs. Wohl bekomm's.

Zuerst will ich Kohl ins Töpfchen schnippeln, gewöhnliches Gemüse, das der Forscher Tag für Tag, meist zur Geschmacklosigkeit verkocht, zu sich nimmt. Ich meine die SDS-Gelelektrophorese. Die beginnt bekanntlich mit dem Aufladen der Probe, und da wäre es oft nützlich zu wissen, wieviel Protein die Probe enthält. So zum Beispiel, wenn man in allen Lanes gleich viel Protein wünscht, oder fürchtet, das Gel zu überladen. Man bräuchte also eine Methode, die das Protein direkt im Probenpuffer bestimmt. Mit den normalen Protein-Bestimmungsmethoden wie Lowry oder Bradford geht das schlecht, weil SDS oder Mercaptoethanol diese Tests gewaltig stören. Was also tun?

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Pierre Chapdelaine, Karin Vignola und Michel Fortier haben in BioTechniques 3 1, 479-482 eine Antwort veröffentlicht. In bewährter Manier (siehe Folge 23 dieser Serie) kombinieren sie zwei alte Methoden zu einer neuen. Die eine ist die Proteinfällung nach Wessel und FIügge. Diese etwas umständliche aber selbst mit kleinsten Mengen zuverlässig arbeitende Methode, habe ich - ich vermerke es mit Stolz - schon in der 1. Auflage des EXPERIMENTATOR-Proteinbiochemie gelobt.

Bei der zweiten Methode spotten Sie eine Proteinlösung auf Nitrozellulose und färben sie anschließend mit Amidoschwarz - was ebenfalls schon seit Jahren bekannt ist. Im einzelnen gehen die Autoren so vor: Das proteinhaltige Zelllysat wird mit Chloroform/Methanol nach Wessel & FIügge ausgefällt und das Pellet in SDS-Probenpuffer aufgenommen. Ein Mikroliter Probenpuffer wird dann auf Nitrozellulose gespottet und daneben eine Eichkurve mit in Probenpuffer gelöstem BSA getupft. Die Nitrozellulose wird getrocknet, mit Amidoschwarz 10B gefärbt und gewaschen. Dies getan, können Sie die Farbdichte der Spots entweder scannen oder mit dem Auge abschätzen. Die Vorteile liegen nicht nur darin, daß Sie wissen, wieviel Protein Sie aufladen. Durch die Chloroform/Methanol Fällung werden Sie auch Schlunz wie RNA/DNA/Lipide los, die bei der Elektrophorese stören.

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Die Methode mag brauchbar sein, ein Geniestreich ist sie nicht. Als Leistung muß man es aber bezeichnen, daß Herr Chapdelaine damit drei Seiten von BioTechniques füllen konnte. Ahmen Sie ihn doch nach: Suchen Sie sich zwei alte Methoden, pappen Sie sie zusammen, und - schwupp - schon haben Sie was zum publizieren. Publizieren ist ja ganz wichtig, deswegen schreib ich es nochmal groß und doppelt: Publizieren, Publizieren. Ich sag immer: In der Wissenschaft kommt es darauf an, ordentlich zu pubsen.


Zweite Zuat: der ELISA

Wir kommen zur nächsten Zutat unseres Gemüseeintopfs. Auch dies ein gewöhnliches Kraut, jeder Krämer führt es, und es heißt ELISA. Hier wird ein Antigen, oft ein Peptid, in ein Well geklebt. Das kann nicht-kovalent geschehen oder kovalent. Ersteres hat den Vorteil der Bequemlichkeit. Die Nachteile sind, daß das Peptid im allgemeinen auf verschiedene Weise adsorbiert wird und sich beim Waschen teilweise wieder ablöst. Besser wäre es, das Peptid kovalent zu binden. Dann könnte man die Platten mehrmals verwenden, denn da die Peptide kovalent gebunden sind, könnten Sie die gebundenen Antikörper z.B. mit saurem pH wieder abwaschen.
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Am besten aber wäre es, die Peptide kovalent so an die Platte zu binden, daß die Antikörperbindungsstelle frei ins Medium ragt. Das ist leider nicht so einfach. Es gibt zwar Platten mit aktivierten Gruppen zu kaufen, aber das Peptid bindet daran wie es gerade lustig ist, mal über eine Lysin-Gruppe, mal über ein Cystein, mal über die N-terminale Aminogruppe. Was tun? "Schützen und spalten", sagen Klaus Gregorius und Michael Theißen in Anal. Biochem. 299, 84-91. Sie synthetisieren ihre Peptidantigene mit Schutzgruppen auf den Lysin- und Cystein-Seitenketten. Das Peptid ,verfügt dann nur noch über eine einzige nucleophile Gruppe, die N-terminale alpha-Aminogruppe. Über diese Gruppe wird das Peptid kovalent an die Mikrotiterplatte gebunden. Die Autoren benützen dazu Platten, die mit tresylaktivierten Dextran-Ketten beschichtet sind (AquaBind). Von diesen Platten sind sie hellauf begeistert, was vermutlich damit zusammenhängt, daß Sie daran finanziell beteiligt sind: Gregorius hat die Tresylbeschichtung anscheinend erfunden. Wie dem auch sein: Nach der Kopplung spaltet man die Schutzgruppen ab und hat jetzt ein auf definierte Weise gebundenes Peptid. Gregorius und Theißen behaupten, daß derart gebundene Peptide von den Antikörpern besser erkannt würden. In ihrem Fall (Patientensera gegen Lyme-Borreliose) soll sich das Signal um einen Faktor 10 verbessert haben.

Schöne Sache? Vielleicht. Vielleicht dann, wenn Sie nebenan einen Peptidsynthesizer stehen haben oder einen guten Menschen kennen, der einen solchen besitzt, und nichts besseres vorhat, als für Sie Fmoc geschützte Peptide herzustellen.
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Das Abspalten der Schutzgruppen dagegen scheint einfach zu sein: Inkubieren mit Hydrazin oder Mercaptoethanol und waschen. Dennoch: Ein beachtlicher Aufwand für eine Signalverbesserung von maximal einer Größenordnung. Könnte man nicht den gleichen Effekt erzielen, indem man zehnmal mehr ungeschütztes Peptid an die Platte bindet? Wird dann die Hintergrundfärbung zu hoch? Und was ist, wenn die Antikörperbindungsstelle ausgerechnet den N-Terminus einschließt?


Als drittes: FIS(c)H!

Fragen über Fragen, die mich nicht weiter belasten, denn ich überlasse sie Ihnen, und komme zur nächsten Zutat meines Ratatouille. Diesmal handelt es sich nicht um Gemüse, sondern um FISH, um einen ziemlich schwer verdaulichen FISH: Um die Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten. In der Klinik sind diese Schnitte üblich und fallen an wie Gurken im Herbst. Doch ist es schwierig, die Hybridisierungsproben durch das formalinfixierte zytoplasmatische Netzwerk in die Kerne zu bekommen. Und das muß man, will man z.B. Chromosomenaberrationen untersuchen. Bisher hat man dazu in der Regel die Kerne isoliert. Das aber zerstört die Schnitte und vernichtet Information. Kim et al. zeigen in BioTechniques 31, 472-474 einen Weg, dieses Problem zu umgehen.

Als Hybridisierungproben verwenden sie nicht DNA- sondern PNA-Proben. Das sind Peptid-Nukleinsäuren, Verbindungen an deren peptidähnliches Rückgrat die Nukleotide mittels Methylencarbonyl-Linker angeheftet sind. Diese PNAs bilden sehr stabile Duplexe mit den komplementären DNA-Sequenzen. Das gibt hohe Schmelztemperaturen und damit große. Empfindlichkeit gegenüber Fehlpaarungen. Mit anderen Worten: PNAs sind die besseren Proben - zumindest glauben das Kim et al.

Entscheidend für die Hybridisierung ist aber nicht nur die Probe, sondern auch die Behandlung der Schnitte. Aus denen wird erstmal mit Xylol das Paraffin herausgewaschen. Dann wässert Kim seine Schnitte mit Alkoholverdünnungen und am Ende mit PBS. Damit ist noch nicht viel gewonnen, denn das eigentliche Diffusionshindernis ist ja das formalinfixierte Proteinnetzwerk und das dürfte Xylol und Schnaps unbeeindruckt überstanden haben. Das Proteinnetzwerk wird jetzt aber mit PBS umspült und kann daher von Proteasen angegriffen und aufgelockert werden. Also gibt Kim - welch genialer Gedanke - Proteinase K zu. Das ist ein Enzym, das fast alle Proteine mit Gier frißt. Die Formalinvernetzung scheint aber diese Gier zu mindern, so daß die Zellarchitektur der Proben intakt bleibt. Dennoch wird das Netzwerk soweit gelockert, daß die Hybridisierungsproben hindurch schlüpfen können. Hat die Protease ihre Arbeit getan, werden die Schnitte mit Alkohol entwässert und getrocknet. Jetzt kann mit PNA hybridisiert werden.

Ich sehe, der Topf ist voll. Bleibt zu sagen, daß alle Zutaten aus dem Herbst 2001 stammen, also noch frisch sein sollten. Falls Ihnen dennoch die eine oder andere aufstößt, beschweren Sie sich bitte bei: hr@Iaborjournal.de




Letzte Änderungen: 08.09.2004


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