Ribosomen brauchen nur wenige Minuten für die Synthese durchschnittlicher Proteine. Ganz so schnell ist der Amidator, den Nina Hartrampf in Bradley Pentelutes Gruppe am Massachussetts Instute of Technology mitentwickelte, noch nicht. Er kann aber innerhalb wenigen Stunden wesentlich längere Peptide beziehungsweise Proteine herstellen als übliche Peptidsynthesizer. Foto: MIT
(08.12.2020) Bei klassischen Peptidsyntheseverfahren ist meist nach fünfzig Aminosäuren das Ende der Fahnenstange erreicht. Mit einer neuen Technik, die die Festphasen-Flow-Chemie für die Verlängerung der Aminosäurekette nutzt, kann man in wenigen Stunden ein funktionsfähiges Protein mit 164 Aminosäuren herstellen.
In den letzten Jahren wurde vermehrt über automatisierte Flow-Chemie-Systeme für Reaktionsoptimierung und Synthese kleiner Moleküle berichtet. Sie bieten viele Vorteile, unter anderem präzise Kontrolle der Reaktionsbedingungen und hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Während meines Postdocs in Bradley Pentelutes Gruppe am Massachussetts Instute of Technology (MIT) haben wir uns die Frage gestellt, ob wir diese Vorzüge auch bei der Festphasen-basierten Synthese von Peptiden nutzen können.
Wir untersuchten dazu die Amidbindungsknüpfung während der Peptidsynthese an einer vollautomatisierten Plattform für Festphasen-Flow-Chemie. Die Amidkupplung ist eine der wichtigsten Reaktionen in der organischen Chemie. Da sie insbesondere bei der Peptidsynthese verwendet wird, konzentrierten wir uns in einem ersten Schritt auf die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren als Bausteine.
Bei der Peptidsynthese knüpft man mehrere Bindungen hintereinander. Weil jede Aminosäure chemisch etwas unterschiedlich ist, ergeben sich selbst bei einem kurzen Peptid schon unzählige Möglichkeiten, wie man Kopplungsreagenzien, Lösungsmittel, Kopplungstemperatur et cetera variieren und kombinieren kann.
Die Reaktion unter Flow-Bedingungen ist ziemlich schnell und dauert nur etwa ein bis zwei Minuten pro Kopplungszyklus. So konnten wir innerhalb weniger Monate einen großen Datensatz zusammentragen und das „Rezept“ für die Synthese von Peptiden immer weiter verfeinern (Science 368(6494): 980-87). Ganz entscheidend bei der Optimierung waren neben der Schnelligkeit noch zwei weitere Faktoren: Wir kontrollierten die Reaktionsbedingungen mithilfe der Flow-Chemie sehr präzise, wodurch Nebenreaktionen minimiert wurden. Zudem erhoben wir mithilfe der Plattform automatisiert analytische Daten, welche uns halfen, die Reaktionsbedingungen miteinander zu vergleichen.
Mit herkömmlichen Methoden kann man dreißig bis fünfzig Amidkupplungen hintereinander durchführen. Mit der von uns entwickelten Technik ist es dagegen möglich, Sequenzen von bis zu maximal 164 Aminosäuren zu synthetisieren – und zwar immer mit dem gleichen optimierten Rezept. Wir mussten die Bedingungen also nicht mehr an besonders herausfordernde Peptidsequenzen anpassen (und davon gibt es bei Peptiden viele!).
Was bedeutet es nun, wenn man Peptide von weit über hundert Aminosäuren innerhalb weniger Stunden chemisch synthetisieren kann? Die von uns hergestellten Peptidsequenzen sind so lang, dass sie nach Aufreinigung und Faltung tatsächlich funktionale Proteine und Enzyme ergeben, die im Labor weiterverwendet und untersucht werden können. Um dies nachzuweisen, synthetisierten wir zum Beispiel die bakterielle RNase Barnase, die wir danach reinigten und schließlich zum aktiven Protein falteten. Parallel dazu stellten wir Barnase auch biologisch mit rekombinanten Methoden her. Anschließend führten wir verschiedene Assays mit beiden Barnase-Varianten durch und stellten fest, dass sie sich tatsächlich ganz ähnlich verhalten.
Was macht man mit der Flow-basierten Proteinsynthese und was ist ihr Vorteil gegenüber der biologischen Expression? Obwohl wir die Optimierung für die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren durchgeführt haben, muss man sich bei der Auswahl der Bausteine unserer chemischen Proteinsynthese keinesfalls mit diesen begnügen. Im Vergleich zur biologischen Synthesefabrik, dem Ribosom, können wir mit unserer Flow-basierten Peptidsynthese-Plattform (Amidator) zum Beispiel beliebig viele unnatürliche Aminosäuren integrieren, die etwa posttranskriptionellen Modifikationen entsprechen – oder auch komplette Proteine aus unnatürlichen Aminosäuren herstellen. Da wir auch spiegelverkehrte Proteine synthetisieren können, könnte man die Flow-basierte Methode auch für den sogenannten Mirror-Image-Phage-Display einsetzen.
Nun kann man sich natürlich fragen, warum dann überhaupt noch jemand rekombinante Proteine exprimiert. Hierauf zu verzichten, wäre jedoch zu voreilig. Neben den oben genannten Vorteilen unserer Methode, hat sie auch Nachteile: Ungeachtet der optimierten Bedingungen ist ein biologisches System häufig präziser, weshalb wir bei der Länge unserer synthetisierten Proteine weiterhin limitiert sind. Und weil wir für unsere Plattform nach wie vor die herkömmlichen Kopplungsreagenzien, Lösungsmittel et cetera verwenden, ist die rekombinante Synthese auch die grünere Herstellungsmethode. Aber was noch nicht ist, kann ja noch werden! Das Potenzial, die gesamte Amidbindungsknüpfung umzudenken und grüner zu gestalten, ist jedenfalls gegeben.
Nachdem wir die Synthese ganzer Proteine demonstriert hatten, wollten wir mit unserer Synthesestrategie noch einen Schritt weitergehen. Die insgesamt über 1.700 von uns hergestellten Peptide enthielten die analytischen Daten von mehr als 35.000 Amidbindungsknüpfungen. Zusammen mit unseren Kooperationspartnern aus der Gomez-Bombarelli-Gruppe am MIT haben wir mithilfe von Deep-Learning-Algorithmen versucht, Vorhersagen über die Synthese zu treffen (ACS Cent. Sci. doi:org/10.1021/acscentsci.0c00979). Kopplungen in der Peptidsynthese sind nämlich nicht nur von dem zu verknüpfenden Baustein abhängig, sondern auch von allen vorher gekoppelten Aminosäuren. Mit den gesammelten Daten wollen wir sequenzspezifischen Synthese-Phänomenen zuvorkommen, um noch höhere Ausbeuten zu erzielen.
Zusammenfassend bietet die Flow-basierte Synthese von Peptiden an der Festphase die Möglichkeit, Reaktionsbedingungen schnell zu optimieren und die Synthesemethoden sowohl an die jeweilige Aminosäure als auch an die Aminosäuresequenz anzupassen. Mithilfe der neuen Technologie lassen sich Peptide und Proteine mit einer Länge von über 100 Aminosäuren innerhalb weniger Stunden synthetisieren. Sie eröffnet zudem die Möglichkeit, chemisch-modifizierte Proteine mit kompletter Kontrolle über jeden einzelnen Aminosäure-Baustein herzustellen.
Nina Hartrampf promovierte bei Dirk Trauner (LMU München) mit der Totalsynthese eines Alkaloids aus Schlangenwein. Nach ihrem Postdoc in Bradley Pentelutes Gruppe am MIT trat sie im März 2020 eine Assistenz-Professur für „Next Generation Synthesis“ an der Universität Zürich an.