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Miniaturisierung im Hochdruck
Proteinreinigung und -analysemit der Flüssigchromatographie

Henrik Müller


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Foto: Universität Leeds

Biowissenschaftler putzen Proteine schon seit Jahrzehnten mit der Flüssigchromatographie. Statt selbstgepackter Chromatographie-Säulen und endloser Mengen Laufmittel wie in den Frühzeiten verwenden sie inzwischen vorgepackte Säulen mit immer kleineren Innendurchmessern und raffinierterem Säulenmaterial.

Bevor Biowissenschaftler die Struktur und Funktion von Proteinen aufklären können, müssen sie diese zunächst reinigen, oder wie es im Laborslang heißt: aufreinigen. So einfach wie in Lehrbüchern beschrieben, läuft die Reinigungs-Prozedur aber nicht immer ab. Viele Jungforscher, die einen Großteil ihrer Doktorarbeit mit der Proteinreinigung zugebracht haben, können davon ein Lied singen. Glücklicherweise kann man inzwischen auf eine große Palette physikalisch-chemischer Trennmethoden zurückgreifen, die sich alle unter dem Oberbegriff Flüssigchromatographie einordnen lassen.

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Die Entwicklung der Flüssigchromatographie begann farbenfroh. Im Jahr 1903 stand der russische Botaniker Mikhail Tswett mit einer Glassäule voller Polysaccharide vor der Warschauer Naturforschenden Gesellschaft. Er goss einen in Leichtbenzin gelösten Chlorophyll-Extrakt auf die Säule und wartete, bis die Schwerkraft ihren Job erledigte. Nach­einander tröpfelten schließlich unterschiedlich gefärbte Lösungsmittelzonen aus dem Ende der Säule heraus. Die Chromatographie, die wörtlich übersetzt Farbschreibung bedeutet, war geboren. Tswett hatte auch schon ihr Prinzip erkannt: „Die Methode basiert auf der Fähigkeit der gelösten Stoffe, physikalische Adsorptionsverbindungen mit verschiedenen mineralischen und festen Körpern einzugehen.“

Schnelle Kommerzialisierung

Spätestens mit den Nobelpreisen 1952 und 1972 für flüssigchromatographische Verfahren traten auch die Hersteller instrumenteller Analysegeräte auf den Plan. Sie hatten Blut geleckt und die kommerziellen Möglichkeiten der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) erkannt. Seitdem ist die HPLC nicht mehr aus dem Labor wegzudenken und insbesondere für Molekular- und Strukturbiologen zu einem ihrer wichtigsten Arbeitspferde geworden.

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Je nach Säulenmaterial werden die Makro­moleküle bei der HPLC aufgrund ihrer Verteilung zwischen nicht-mischbaren Phasen, über ihre Affinität zu immobilisierten Liganden sowie durch Ionenaustauschvorgänge oder Sieb­effekte getrennt. Mit der HPLC ist es aber nicht nur möglich, Biomoleküle – insbesondere Proteine – sauber auseinander zu dividieren. Sie ist auch ein wichtiges Werkzeug, um biologische, pharmazeutische und klinische Proben zu analysieren und zu charakterisieren. In Zeiten, in denen die Anforderungen an Ausbeute, Reinheit, Homogenität, strukturelle Konformität und Aktivität von Proteinen immer höher werden, ist dies vielleicht ihr größter Trumpf.

Die Trennleistung der HPLC wird durch die Van-Deemter-Gleichung beschrieben. Wer sich in die chromatographische Dispersion oder in Modelle für Trennstufenhöhen und kinetische Leistungsgrenzen einlesen möchte, dem sei der vor zwei Monaten erschienene Review der belgischen Chromatographie-Spezialisten um Sebastiaan Eeltink vom Department of Chemical Engineering der Freien Universität Brüssel empfohlen (J. Sep. Sci., 42(1)).

In der Praxis setzen vier von fünf Biowissenschaftler aber einfach auf die ­Affinitätschromatographie als ersten Aufreinigungs-Schritt. Dabei müssen sie die Vor- und Nachteile von gut drei Dutzend erhältlichen Affinitäts-tags abwägen. Zwar nicht topaktuell, aber dennoch empfehlenswert, um den Überblick zu behalten, sind die Reviews von Kimple et al. (Curr. Protoc. Protein Sci., 2013; 73) und Yadav et al. (Arch. Biochem. Biophys., 612: 57-77).

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Affinitätschromatographischer Goldstandard ist nach wie vor die Immobilisierte-Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) mit Nickel-Nitrilotriessigsäure (NTA)-Säulen zur spezifischen Abtrennung Histidin-getaggter Proteine. Hohe Bindungskapazität und Salztoleranz sowie niedrige Kosten aufgrund der einfachen Säulen-Regeneration überzeugen die meisten Biowissenschaftler.

Extreme Affinität

Keines der bisherigen Protokolle kommt allerdings ohne weitere Aufreinigungs-Schritte aus. Das nahm die Gruppe des Proteinkristallographen Dmitry G. Vassylyev von der University of Alabama zum Anlass, eine affinitätschromatographische Ein-Schritt-Aufreinigung zu entwickeln (Proc. Natl. Acad. Sci., 114(26)). Diese beruht auf der hochaffinen Wechselwirkung der inaktivierten Colicin-E7-DNase (CL7) mit ihrem Inhibitor Immunity Protein 7 (Im7). Doch warum sollte diese besser funktionieren als beispielsweise die Interaktion von Polyhistidin-Liganden mit NTA? Weil die Dissoziationskonstante des Komplexes von 10-14 bis 10-17 M selbst die meisten Antikörper blass aus­sehen lässt – und herkömmliche Affinitäts-Liganden wie FLAG, GST, MBP, Strep, Protein A oder Polyhistidin erst recht.

Zugegebenermaßen beeinflusst das mit dem Zielprotein fusionierte 16 kDa schwere CL7 dessen korrekte Faltung eher als ein Polyhistidin-tag. Und CL7 muss noch immer mittels SUMO- oder PreScission-Protease abgetrennt werden. Dafür erlaubt die extrem hohe Affinität von Im7 zu CL7 aber sogar die Aufreinigung aus Zell-Lysat ohne vorherige Überexpression. Selbst hohe Salzkonzentrationen, Chelatbildner und reduzierende Reagenzien sind im Gegensatz zum Polyhistidin-System kein Problem.

Die Hochleistungs-Affinitätschromatographie (HPAC) beschränkt sich aber nicht nur auf Aufreinigungszwecke. Als stationäre Phase dienen Immunoglobulin-bindende Proteine, Aptamere, Enzyme, Lektine, Transportproteine, Kohlenhydrate und Lipide in unterschiedlichen Trenn-Formaten. Die Wechselwirkungen bei diesen chromatographischen Immuno­assays werden mit Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-Techniken, thermometrisch oder elektro­chemisch detektiert.

Aptamere als Liganden

So füllte beispielsweise eine südkoreanische Gruppe eine 400-Nanoliter-Mikrochip-Kammer mit Polystyrol-Mikrokügelchen, an die über eine photolytische Esterbindung RNA-Aptamere gebunden waren. Anschließend injizierten die Forscher ein Proteingemisch in die Mikrokammer, wuschen ausgiebig und eluierten spezifisch gebundene Proteine nach vorheriger UV-Spaltung. Mit dieser HPAC im Mikromaßstab reinigten die Koreaner Zielproteine, die sie dem Proteingemisch in einer Konzen­tration von wenigen Femtomol hinzugegeben hatten (Electrophoresis 26(3): 694-702).

Aptamere bieten aber noch weitere Vorteile. Im Gegensatz zu proteinogenen Liganden ist ihre Spezifität einfach justierbar. Zudem sind sie reversibel denaturierbar und auch in Gegenwart von Proteasen stabil.

Künstliche Membran

Inzwischen werden HPAC-Säulen sogar als künstliche Membranen eingesetzt. Die Forschergruppe um Frédéric Lynen vom Department of Organic and Macromolecular Chemistry der Universität Ghent verankerte Monolayer aus Phosphatidylcholin, Sphingomyelin und Cholesterol kovalent auf der Oberfläche von Silica-Partikeln. Damit simulierte sie die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke für Medikamente des zentralen Nervensystems (Ana.Bioanal. Chem., 406(25): 6179-88).

Die Belgier bestimmten die Verteilungskoeffizienten zwischen mobiler Methanol/PBS-Phase und stationärer Lipid-Phase für knapp fünfzig chemische Verbindungen. Darunter das Krebsmittel Chlorambucil, das Injektions-Narkotikum Hexobarbital und das Schmerzmittel Ibuprofen. Die Verteilungskoeffizienten des artifiziellen Systems korrelierten erstaunlich gut mit Werten, die mühevoll in Tierexperimenten ermittelt wurden. Inzwischen sind die Säulen für diese Immobilised Artificial Membrane (IAM) Chromatographie auch kommerziell erhältlich.

Günstige Impfstoffreinigung

Auch Pharmafirmen haben das Potenzial der HPAC erkannt, allen voran Impfstoffhersteller, die achtzig Prozent der Herstellungskosten für Aufreinigungs-Schritte ausgeben. Die konzeptionelle Einfachheit der HPAC und vor allem ihre Fähigkeit, Verunreinigungen effektiv zu entfernen, versprechen enorme Kostenreduzierungen.

Inzwischen ist auch die Implementierung im industriellen Maßstab in vollem Gange. So fördert zum Beispiel die EU das auf fünf Jahre angelegte Projekt DiViNe (https://divineproject.eu/) mit 5,8 Millionen Euro, in dem die Firmen iBET, Affilogic, Aquaporin, Merck KGaA, GenIbet Biopharmaceuticals und GSK kooperieren. Ziel ist es, umweltfreundliche und erschwingliche Vakzine mittels HPAC für Entwicklungsländer herzustellen.

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Monolytische Säulenpackungen bilden ein dichtes schwammartiges Netzwerk, durch das die mobile Phase mit hoher Geschwindigkeit fließt. Die Art und Größe der Poren lässt sich exakt einstellen. Foto: Shanghai Normal University
Immer dünnere Säulen

Bei chromatographischen Säulen, zum Beispiel für die Größenausschluss-Chromatographie (SEC), setzt sich die Entwicklung zu immer kleineren Innendurchmessern fort. Der Miniaturisierungs-Trend hat aber mehr als nur ästhetische Gründe. Die geringeren Volumina der sogenannten Ultra-High-Performance (UHP)-Säulen verbessern die Auflösung, steigern die Empfindlichkeit und erhöhen den Probendurchsatz. UHP-SEC-Säulen werden nicht mehr wie klassische HPLC-Säulen mit porösen 10-bis 100-µm-Silica-Partikeln beladen. Die Durchmesser der verwendeten Säulenpartikel, die nur noch auf ihrer Oberfläche eine poröse Struktur aufweisen (Superficially Porous Particles, SPP) liegen inzwischen unter 2 µm. Die Trennzeiten verkürzen sich hierdurch auf wenige Minuten.

Klingt einfach? Ist es aber nicht. Denn zahlreiche Säuleneigenschaften beeinflussen sich gegenseitig. Die chemische Zusammensetzung des Säulenmaterials, Partikelgröße und Partikelform, mechanische Festigkeit, Porengröße, interstitielles Volumen, Säulenlänge und innerer Durchmesser, Flussrate, ja selbst das Größenverhältnis von festem Partikel-Kern zum gesamten SPP-Durchmesser müssen optimiert werden.

Aus praktischer Sicht sind, nach einem Review der Gruppe um Szabolcs Fekete von der Universität Genf, aktuell 2,7 µm-SPPs mit 1.000 Å-Poren am besten geeignet, um große Biomoleküle mit hunderten kDa binnen weniger Minuten aufzutrennen (J. Pharm. Biomed. Anal., 158: 225-35).

Die Optimierung trennstarker HPLC-Säulen geht kontinuierlich weiter. Dünnere Partikeloberflächen oder Partikel aus mehreren Schichten unterschiedlicher Porengröße, sogenannte Bi-Shell Particles, versprechen noch kürzere Elutionszeiten. SPPs werden bisher hauptsächlich in SEC und Umkehrphasen (RP)-HPLC eingesetzt. Aber auch Hydrophile Interaktions-Chromatographie (HILIC) und Ionenaustausch-Chromatographie (IEX) profitieren von dieser Entwicklung. So sind bereits ­HILIC-Säulen mit 2,6 µm SPP, etwa zur Polysaccharid-Analyse erhältlich.

Ein weiterer Trend ist die Verwendung monolithischer Säulenpackungen mit schwamm­artigen Strukturen, die durch die Polymerisation von Monomeren gewonnen werden. Monolithen haben eine Reihe von Vorteilen gegenüber Partikel-basierten Trägermaterialien. So lässt sich zum Beispiel ihre Porosität und Porengröße maßschneidern und auf Trenngeschwindigkeit oder Effizienz trimmen. Hinzu kommt, dass man die Polymerisationsmischung in beliebige Formen gießen kann, um zum Beispiel dicke präparative oder filigrane analytische Säulen herzustellen.

Höhere Flussraten

Da monolithische Phasen außerdem höhere Flussraten ermöglichen und bessere Trenn­eigenschaften besitzen, dürfte ihnen die Zukunft gehören. Kopfschmerzen bereitet den Säulenherstellern aber noch die ­strukturelle­ Inhomogenität der Monolithe. Diese führt zur sogenannten Wirbeldiffusion, die Analyte nicht ­linear sondern im Zickzackkurs durch das Trennbett wandern lässt. Die Folge ist eine unschöne Bandenverbreiterung. Dennoch offerieren alle großen Säulenanbieter monolithische LC-Säulen zur Protein-Identifikation. Einige Auguren schätzen den Markt­umfang für Chromatographie-Säulen im Jahr 2024 auf knapp drei Milliarden Euro. Wer die strukturelle Inhomogenität als erstes in den Griff bekommt und monolithische Säulen mit einer verbesserten Trennleistung anbieten kann, könnte sich eine goldene Nase verdienen.

Auch weitere Spielarten etwa die Superkritische Flüssigkeitschromatographie (SFC) oder die Mixed-Mode-Chromatographie (MM-HPLC) warten nur darauf, für die Trennung und Analyse biologischer Makromoleküle eingesetzt zu werden. MM-Säulen vereinen das Prinzip des Ionenaustauschs mit dem Trennmechanismus der RP-HPLC. Mit ihnen ist es möglich, rekombinante Proteine ohne Liganden in einem Schritt aufzureinigen.

Einen Überblick zur MM-HPLC erhält man zum Beispiel in einem Review der Chromatographie-Spezialisten Kelly Zhang und Xiaodong Liu von den Firmen Genentech beziehungsweise Thermo Fisher Scientific (J. Pharm. Biomed. Anal., 130, 19-34).

Verlustquelle Nummer eins während der Aufreinigung von Proteinen ist nach wie vor die Protein-Aggregation. Mit den Liganden, die Vasiliki Paraskevopoulou und Franco Falcone in Tabelle 1 ihres Reviews aufführen, lässt sich die Löslichkeit vieler Zielproteine jedoch erhöhen – auch wenn ihre Vielzahl den Leser zunächst schier erschlägt (Microorganisms 6, 47).

Häufig ist der letzte Aufreinigungs-Schritt dennoch eine SEC zur Abtrennung unerwünschter Aggregate. Die SEC ist auch das beliebteste Werkzeug zur Quantifizierung der Größenverteilung und Aggregationskinetik von Monomer-Oligomer-Gemischen. In Kombination mit UV- und Fluoreszenz-Detektion, Mehrfachwinkel-Lichtstreuung (MALS), dynamischer Lichtstreuung (DLS) oder Elektrosprayionisation (ESI)-Massenspektrometrie (MS) erlaubt sie nicht nur die Charakterisierung von Proteinstrukturen höherer Ordnung. Auch Fragmente, molekulare Verunreinigungen und posttranslationale Modifikationen können im Handumdrehen identifiziert werden.

Kurze Trennzeiten

Selbst konformationelle Änderungen gelöster Proteine kann man mit der SEC erkennen (J Chromatogr A, 1496, 51-57). Damit steht dem Hochdurchsatz-Screening von Proteinchargen nichts mehr im Weg. Die kurzen Trennzeiten moderner UHP-SEC-Säulen erlauben es, nach Reinheit, Homogenität und struktureller Konformität zu selektionieren, um damit zum Beispiel enzymatische Reaktionen effizient zu optimieren. Genauere Infos zu modernen UHP-SEC-Säulen findet man im Review von Szabolcs Feketes Gruppe (J. Pharm. Biomed., 158, 225-235).

Auch bei der analytischen HPLC ist die Miniaturisierung der Partikelgröße das heiße Thema der letzten Jahre. Üblich sind inzwischen Sub-2 µm-Silica-Partikel, die häufig mit Octadecylsilan (C18-Säulen) derivatisiert sind. Im gleichen Maß wie die Partikelgrößen schrumpfen auch die Innendurchmesser der Säulen. Bei der sogenannten Nano-HPLC werden statt der üblichen 4,6 Millimeter Innendurchmesser mittlerweile Säulen mit weniger als 0,1 Millimeter verwendet. Unter Hochdruck werden 200 bis 300 Nanoliter Laufmittel pro Minute durch die Kapillaren gepumpt. Da die Analyten in diesen winzigen Volumina stärker konzentriert sind, kommen am Detektor, üblicherweise ein Massenspektrometer, auch mehr an.

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Carla Schmidt (5.v.l. ) untersucht mit ihrer Nachwuchsgruppe die Funktion von Membranproteinkomplexen mit Nano-HPLC und Massenspektrometer. Foto: Henrik Müller
Nano-HPLC

Carla Schmidt, die am Zentrum für Innovationskompetenz HALOmem der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (MLU) eine Nachwuchsgruppe leitet, meint dazu: „Für die Nano-HPLC braucht man heutzutage kein Spezialist mehr sein. Etliche kommerzielle Hersteller bieten Baukastensysteme an, mit denen man auf hohem Niveau Forschung betreiben kann.“ Die rasante Entwicklung von Flüssigchromatographie und Massenspektro­metrie (LC-MS) ist für sie ein Segen. „Früher musste ich noch ständig den Schraubenschlüssel in die Hand nehmen. Heute nur noch, falls mal etwas kaputt geht.“

Moderne Nano-LC-Systeme, die zumeist mit Massenspektrometern kombiniert werden, nehmen den Benutzern das gröbste ab. Schmidt nutzt sie, um Protein-Lipid-Komplexe der synaptischen Membran zu untersuchen. Dazu vernetzen ihre Mitarbeiter direkte Kontaktstellen innerhalb der Komplexe chemisch, verdauen sie dann proteolytisch und trennen die gespaltenen Peptide mithilfe der SEC/Nano-HPLC/MS.

„Die Informationen aus den Datenmengen, die wir damit erhalten, haben wir längst noch nicht ausgeschöpft.“ Lachend fügt sie hinzu: „Letzte Woche haben wir in einer vierstündigen Nano-HPLC mit einem Lösungsmittel-Gradienten das gesamte Hefeproteom aufgetrennt. Viel länger werden wir brauchen, es auch nur ein wenig zu verstehen. An die Myriaden posttranslationaler Modifikationen will ich noch gar nicht denken...“ Klingt so, als sei die Nano-HPLC in Proteomik, Lipidomik und Glykomik bereits heute unverzichtbar geworden.

Noch etliche Baustellen

Was aber nicht heißen soll, dass es keine Baustellen mehr gibt. „Die heutige Analysesoftware ist viel benutzerfreundlicher. Trotzdem benötigen Routinearbeiten wie die Datenprozessierung noch zu viel Zeit“, erklärt Schmidt. „Auch bei Eigendiagnose und -wartung muss noch mehr automatisiert werden. Das ist noch zu viel Fummel-Arbeit. Sobald man sich von Standardeinstellungen wegbewegt, ist die Reproduzierbarkeit noch immer ein Problem.“

Für komplexe Mischungen verwendet Schmidt die sogenannte zweidimensionale (2D)-HPLC, bei der zwei Trennsäulen miteinander verknüpft werden. Der Trick besteht darin, das Eluat der ersten Dimension über ein Modulationsventil auf eine weitere Trennsäule zu leiten. Wird das komplette erste Eluat fraktionsweise aufgetrennt, spricht man von comprehensive 2D-LC oder LCxLC. Werden nur bestimmte Fraktionen gezielt für die zweite Dimension injiziert, ist von heart-cutting 2D-LC oder LC-LC die Rede. Letzteres spart natürlich enorm viel Zeit.

Schmidt separiert die Spaltpeptide zunächst mit der SEC nach ihrem hydrodynamischen Radius. Dann ordnet sie sie mittels Nano-RP-HPLC nach ihrer Hydrophobizität. Die 2D-Trennleistung ist um ein Vielfaches höher als die der einzelnen Säulen, da sich ihr Auflösungsvermögen multipliziert. Was umso besser funktioniert, je verschiedener beide Trennmechanismen sind. Üblicherweise folgt auf Ionenaustausch- oder hydrophile Interaktions-Chromatographie eine RP-HPLC. Verwendet man die RP-HPLC in beiden Dimensionen, variiert man in einer Dimension den pH-Wert. Die RP-HPLC ist in der zweiten Dimension besonders beliebt, weil die benötigten Säulen schnell und zu verschiedenen Lösungsmitteln passend erhältlich sind.

Schnell und effektiv

Die Zeitersparnis mit der 2D-HPLC ist beträchtlich, wodurch sich unterer anderem auch die Betriebskosten reduzieren. Die gewonnene Zeit ist aber nicht der einzige Vorteil. Sind in dem zu trennenden Gemisch zum Beispiel Verbindungen mit mehreren chiralen Zentren enthalten oder besteht es aus einer Mischung von Wirkstoff und Benetzungs-Mittel, gelingt es mit der 1D-LC häufig nicht mehr, die einzelnen Bestandteile sauber zu trennen.

Mittlerweile haben kommerzielle 2D-LC-Systeme ihre selbst zusammen­geschusterten Pendants in vielen Laboren abgelöst. Auch in den Forschungs- und Entwicklungsabteilungen der biopharmazeutischen Industrie erfreut sich die 2D-HPLC zunehmender Beliebtheit. Inwieweit 2D-LC-Methoden den Sprung in industrielle Umgebungen schaffen werden, in denen Qualitätssicherung und Good Manufacturing Practice maßgeblich sind, muss man aber sehen. Ohne Zweifel werden Forscher jedoch daran arbeiten, die Reproduzierbarkeit, Präzision und Flexibilität der 2D-HPLC in den nächsten Jahren systematisch zu verbessern. Und wer weiß, wie viele Dimensionen dann noch hinzukommen.



Letzte Änderungen: 08.03.2019


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