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Metabolische Sequenzierung
Dosiertes LED-Licht für Optogenetik

Kathrin Brenker


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Pipetten­spitzen kommen direkt mit Ihren Proben in Kontakt. Rein­heit und Quali­tät sind wichtig für die Effi­zienz und Sicher­heit Ihrer Ana­lysen mehr

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Das Probenröhrchen mit den Zellen wird in dem Be­leuch­tungs­modul platziert. Das Ganze ist mit einer Steuer­einheit verbunden, die für die Kühlung der Proben sowie eine dosierte Beleuch­tung sorgt. Für die Analyse der Zellen wird das Modul in die Proben­auf­nahme eines Durch­fluss­zytometers eingebunden. Foto: Kathrin Brenker

Optogenetiker nutzen lichtsensitive Proteine, um zelluläre Prozesse mit Licht zu kontrollieren. Den wenigsten Zellen gefällt es jedoch, wenn sie zu sehr im Rampenlicht stehen. Ein cleveres Belichtungsmodul mit integrierter Kühlung hält sie am Leben und erleichtert optogenetische Analysen mit dem Durchflussytometer.

Spätestens seit die Optogenetik 2010 von Nature zur Methode des Jahres gekürt wurde, hat sie den Sprung von den Neurowissenschaften in die allgemeine Zellbiologie geschafft. Der Traum, intrazelluläre Prozesse mit Licht fernzusteuern, ist Wirklichkeit geworden. Nicht zuletzt deshalb ging etwa der kanadische Gairdner Award in diesm Jahr an die drei Pioniere der Optogenetik, Karl Deisseroth, Edward S. Boyden und Peter Hegemann. Ein weiterer Meilenstein war die Behandlung des Melanoms einer Maus mit einer optogenetischen Immuntherapie, die 2017 gelang (Nature Comm 8, 15365).

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Um zelluläre Signalwege mithilfe von Licht steuern zu können, nutzen Optogenetiker lichtempfindliche Proteine, die ihre Konformation und Affinität verändern, wenn sie mit Licht einer spezifischen Wellenlänge bestrahlt werden. Die Liste optogenetischer Proteine ist inzwischen ziemlich lang und wächst stetig. Fusioniert man sie mit entsprechenden Zielproteinen, lassen sich auch diese mit Licht kontrollieren – reversibel und mit hoher zeitlicher sowie räumlicher Auflösung.

Präzise Beleuchtung

Die Hürden für optogenetische Zellsysteme sind dank moderner Klonierungsmethoden sehr niedrig. Die Herausforderungen liegen vielmehr im experimentellen Design und bei der Analyse. Ein entscheidender Knackpunkt ist die präzise Belichtung der Zellen. Während Antikörper und andere Stimulantien auf ein Zehntel Mikroliter genau pipettiert werden können, ist die Belichtung optogenetischer Proben wesentlich ungenauer. Zwar kann man Wellenlängen-spezifische LEDs in fast jeder Form und Größe kaufen – ihre Intensität lässt sich jedoch in den seltensten Fällen so fein dosieren, wie es für optogenetische Experimente nötig ist.

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Während meiner Doktorarbeit in Michael Reths Arbeitsgruppe am Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg, wünschte ich mir regelmäßig drei Arme: Einen, um die LED-Taschenlampen (für jede Wellenlänge eine) an das Probengefäß zu halten; einen, um gleichzeitig den Timer und die Taschenlampen anzustellen; und den Dritten, um zu pipettieren. Dabei hatte jeder experimentelle Aufbau seine eigenen Herausforderungen: Wahlweise mussten Zellen auf Eis, im Inkubator oder am Durchflusszytometer belichtet werden.

Besonders frustrierend waren optogenetische Experimente am Durchflusszytometer. Hier konnte man den Zellen beim Sterben zusehen, weil sie die starke Erwärmung durch Licht längerer Wellenlänge nicht überlebten. Zudem war aus den generierten Daten abzulesen, dass die Belichtung der Zellen mit LED-Taschenlampen weder homogen noch zwischen einzelnen Experimenten reproduzierbar war. Auch komplizierte und kreative Stativ-Aufbauten rund um das Durchflusszytometer verbesserten die Situation nur marginal.

Uns blieb letztlich nichts anderes übrig, als selbst ein Belichtungsmodul zu entwickeln, mit dem wir optogenetische Experimente am Durchflusszytometer durchführen konnten. Heraus kam ein kleiner Zylinder, in dem ein FACS-Tube mit radial angebrachten LEDs beleuchtet wird. Ein angeschlossener Wasser-Kryostat hält die Temperatur stabil.

Große Arbeitserleichterung

Optogenetische Experimente werden hierdurch deutlich erleichtert. Das Belichtungsmodul wird an den Kryostat angeschlossen und samt FACS-Tube an das Zytometer montiert. Belichtungsdauer und -intensität lassen sich mit einer Software steuern, Lichtprotokolle können abgespeichert und beim nächsten Experiment wiederverwendet werden. Durch die identischen Belichtungsbedingungen ist es möglich, verschiedene Readouts miteinander zu vergleichen.

Der angeschlossene Kryostat sorgt für eine gleichmäßige Temperatur, wodurch ungewollte Schwankungen zum Beispiel bei ­Calcium-Flux-Messungen verhindert werden. Falls erforderlich, kann man reagierende von nicht reagierenden Zellen in einem Cell-Sorter trennen. Die belichteten Zellen lassen sich für beliebige andere Analysen verwenden, etwa für Western Blots oder Antikörper-Färbungen.

Inzwischen ist aus dem Belichtungs-Projekt ein dreiköpfiges Spin-Off der Universität Freiburg hervorgegangen, das Belichtungsmodule für optogenetische Experimente entwickelt. Wir erhalten regelmäßig Anfragen von Forschern, die ähnliche Beleuchtungs-Probleme haben wie ich bei meiner Doktorarbeit. Die Arbeit an Systemen für die kontrollierte Belichtung optogenetischer Experimente dürfte uns also so schnell nicht ausgehen.

(Kathrin Brenker ist Mitgründerin des Spin-Offs Opto Biolabs der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg)



Letzte Änderungen: 10.10.2018


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