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Interview mit dem Nanoinjektions-Spezialisten Simon Hennig

„Spitzen mit 100 Nanometer Durchmesser sind erst der Anfang“

Interview: Andrea Pitzschke


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Simon Hennig Foto: Uni Bielefeld

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Simon Hennig konstruierte mit seiner Gruppe einen Nanoinjektor für die schonende Transformation fixierter, lebender Zellen. Laborjournal wollte von ihm wissen, welche Vorteile das neue Verfahren bietet.

Die Nanoinjektion ist keine Massenabfertigung, und jede zu behandelnde Zelle kommt einzeln dran. Wie viele Zellen schafft ein erfahrener „Nanoinjektor“ binnen einer Stunde?

Simon Hennig » Die Anzahl der Zellen hängt tatsächlich von der Erfahrung des Nutzers ab. Da bei der Nanoinjektion schrittweise angenähert wird und der Nutzer ein Feedback der aktuellen Position der Pipettenspitze über den Ionenstrom erhält, dauert eine Annäherung circa zehn bis zwanzig Sekunden. Danach weiß der Nutzer allerdings auch genau, dass er definitiv in der Zelle ist. Er weiß auch, ob er im Zytoplasma oder im Zellkern ist. Dann kommt die Injektion selbst. Die Dauer der Injektion hängt natürlich von der Ladung der Moleküle und deren Größe ab, da die Nanoinjektion nicht druckbasiert arbeitet, sondern über Elektrophorese, beziehungsweise Dielektrophorese. Das alles geht relativ langsam, so dass bei einer Injektion zwischen fünf Sekunden und fünf Minuten vergehen können, bis die beabsichtigte Menge an Molekülen in die Zelle injiziert ist. Daher hängt die Anzahl der Zellen, die mit Nanoinjektion pro Stunde behandelt werden können, sehr stark von den Eigenschaften der zu injizierenden Moleküle ab. Typischerweise liegen unsere Erfahrungswerte bei circa zwanzig bis dreißig Zellen pro Stunde.

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Ist es möglich vorab ein relativ großes Volumen der zu applizierenden Flüssigkeit aufzunehmen und sukzessiv an einzelne Zellen abzugeben (ähnlich wie bei Multipipetten)?

Hennig » Die Nanopipette wird mit circa zehn Mikroliter Volumen gefüllt. Typische Konzentrationen der Moleküle in der Nanopipette liegen bei 10-4 bis 10-7 mol. Die Menge an Molekülen innerhalb der Pipette, die in Zellen transferiert werden kann, ist deshalb sehr hoch. In unseren Experimenten müssen wir daher die Pipette nicht „nachladen“. Typischerweise reicht eine Pipettenfüllung für jeweils ein komplettes Experiment.

Haben Sie die Nanoinjektion schon einmal bei viskoseren Substanzen angewendet?

Hennig » Nein, hohe Viskositäten haben wir bisher immer zu vermeiden versucht, da dadurch die Bewegung der Moleküle innerhalb der Pipette stark herabgesetzt wird.

Enzyme sind ja häufig in Glycerol gelöst. Schafft man es dann überhaupt, in der in Ihrem Paper angegebenen akzeptablen Dauer von einer Minute, genügend Material in die Zelle zu drücken, oder wäre in diesem Fall eine höhere Spannung ratsam?

Hennig » Wenn man eine solche Situation mit hoher Viskosität nicht vermeiden kann, wäre es auf jeden Fall ratsam die Spannung nicht zu erhöhen. Ich würde lieber dazu übergehen, die gewünschte Gesamtmenge an injizierten Molekülen über eine Mehrschrittinjektion zu erreichen. Das würde heißen, dass ich jeweils eine Minute bei entsprechender Spannung injiziere und dazwischen Pausen einlege. Alternativ könnte man auch über Zweikanalpipetten nachdenken. Hier wird die Gegenelektrode im zweiten Kanal platziert. Das hat den Vorteil, dass sich das elektrische Feld nur an der Spitze der Pipette konzentriert. Hier haben wir aber noch keine ausreichenden Daten zur Überlebensrate gesammelt. Es wäre aber gut möglich, dass aufgrund der unterschiedlichen Konfiguration des elektrischen Feldes höhere Spannungen bei einer garantierten Überlebensraten nahe 100 Prozent möglich sind.

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Was ist ungefähr das maximal applizierbare Volumen; die Zellen sollen schließlich nicht platzen. Oder wird das Volumen ohnehin schon durch den Pipettendurchmesser und die akzeptierte Injektionsdauer limitiert?

Hennig » Wir gehen derzeit davon aus, dass das transferierte Volumen vernachlässigbar ist. Das Prinzip der Nanoinjektion basiert ja darauf, dass faktisch nur die Moleküle durch Kräfte, die durch das elektrische Feld hervorgerufen werden, von der Pipette in die Zelle „wandern“, was in der Funktionsweise schon sehr viel anders ist als die konventionelle Mikroinjektion. Dadurch, dass die Nanoinjektion nicht mit Druck arbeitet, ergibt sich natürlich eine hohe Überlebensrate, weil die Zelle bei der Injektion nicht platzen kann. Natürlich sind aufgrund des Funktionsprinzips auch sehr viel kleinere Spitzendurchmesser möglich. Die derzeit verwendeten Spitzen mit 100 Nanometer Durchmesser sind da erst der Anfang. Theoretisch kann man auch mit zehn Nanometer Spitzen arbeiten.

Hypothetisches Szenario: Wirkstoff A und B sollen separat in die Zelle gelangen. Nehmen wir an, A und B in Reinform flocken aus oder sind anderweitig inkompatibel. Oder man möchte in vivo verfolgen, wie sich zwei Interaktionspartner finden (ohne diese vorher zu einer in vitro Partnerschaft in der Pipette zu zwingen). Daher die Frage: Ist dieselbe Zelle mehrfach anstechbar? Lässt sich A und B mit je einer Pipette von links beziehungsweise rechts einschleusen?

Hennig » Prinzipiell wäre ein solches Szenario gut denkbar. Die Zelle würde sich sowohl mehrfach anstechen lassen, wobei dann der Ort innerhalb der Zelle auf wenige 100 Nanometer bestimmt werden könnte. Es wäre zudem denkbar, dass man Wirkstoff A in den Zellkern und Wirkstoff B in das Zytoplasma injiziert. Versuche mit zwei Nanopipetten gleichzeitig haben wir bisher noch nicht gemacht. Dies sollte aber nur ein technisches Problem sein, das zu lösen ist. Prinzipiell aber auf jeden Fall machbar.

Die Fraktionierung von Zellkompartimenten mit Aufschlussverfahren und Zentrifugation erlaubt immer nur bestimmte Kompartimente anzureichern, aber nicht in Reinform zu isolieren. Auch kommen Moleküle ungewollt im Eppi zueinander, die sich in vivo nie begegnen würden. Wenn für eine Cytosol-Analyse nur winzige Mengen benötigt würden, wäre dann die Nano“re“jektion, also Flüssigkeit absaugen mit der Nanopipette, eine denkbare Alternative?

Hennig » Das direkte Absaugen von Volumen aus der Zelle ist mit der Nanoinjektion, wie wir sie betreiben, derzeit nicht möglich, da in diesem Fall nur die geladenen Moleküle aus der Zelle in die Pipette wandern würden. Es gibt aber Ansätze, die eine solche „Nanobiopsy“ verfolgen (ACS Nano 8: 546 - 53).

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Ein kleiner Piekser mit der Nanopipette in eine Nierenzelle um ein Farbstoffmolekül in diese einzuschleusen, ... Foto: Uni Bielefeld

Sie zeigen, dass Substanzen gezielt in den Zellkern injiziert werden können. Bedenkt man die Feinheit der Pipette, müsste das doch auch für andere Kompartimente (Mitochondrien circa 4 x 0,8 µm) funktionieren. Wo sehen Sie mögliche Hürden?

Hennig » Mögliche Hürden sind natürlich die Größe der Kompartimente. Derzeit haben wir eine laterale Positionierpräzision von circa 300 Nanometer. Die Kompartimente sollten also nicht kleiner sein. Dazu kommt, dass wir für eine genaue axiale Positionsbestimmung auf den Ionenstrom angewiesen sind. Das heißt, wir brauchen eine Membran, die einen elektrischen Widerstand erzeugt, um anhand des abnehmenden Ionenstroms zu sehen, dass die Pipettenspitze die Membran des Kompartiments durchstoßen hat. Für diesen Prozess muss eine Kraft auf die Membran ausgeübt werden; und damit eine Gegenkraft des Kompartiments durch Verankerung innerhalb der Zelle oder durch den Zellboden vorhanden sein. Nur so kann die Spitze in das Kompartiment hineingedrückt werden. Ein weiterer Aspekt ist natürlich in lebenden Zellen die Beweglichkeit des Kompartiments. Da die Annäherung ein paar Sekunden dauert, sollte sich das Ziel in der Zeit nicht signifikant weiterbewegt haben. Im Fall der angesprochenen Mitochondrien wäre es rein von der Größe gesehen kein Problem. Auch die Membran sollte genügend elektrischen Widerstand bieten, um eine Annäherung sichtbar zu machen. Allerdings sind Mitochondrien sehr beweglich und in der Zelle nicht gut genug verankert, sodass alles in allem die Chancen nicht gut sind, mit einer Injektion Erfolg zu haben.

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... und schon fluoresziert die Zelle Foto: Uni Bielefeld

Für wie wahrscheinlich halten Sie es, dass Mikroinjektions- und Nanoinjektionsstudien, im selben biologischen System, teilweise kontroverse Ergebnisse liefern könnten? Bei der Mikroinjektion werden unvermeidlich ein paar Zellen beschädigt oder zerstört. Die Bruchteile werden von unbeschädigten Zellen als Stresssignal (zum Beispiel DAMPs – damage-associated molecular patterns) wahrgenommen und können ungewollt Signalwege auslösen. Dies würde bei der Nanoinjektion praktisch wegfallen. Natürlich ist immer die Kontrollprobe (Injektion ohne Effektorsubstanz) dabei, doch wenn applizierter Effektor und DAMPs synergistisch, antagonistisch et cetera agieren, wird es kompliziert...

Hennig » Das Experiment Nanoinjektion versus Mikroinjektion in ein und demselben System wäre sicherlich eine sehr interessante Studie. Zu den angesprochenen möglichen Einflüssen zählt auch das applizierte elektrische Feld, was dann bei der Nanoinjektion zumindest teilweise auch auf die mikroinjizierten Zellen wirken würde.



Letzte Änderungen: 14.09.2017


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