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Nanopiekser

Nanoinjektions-Technik

Andrea Pitzschke


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Eine neue Nanoinjektions-Technik erhöht die Überlebensrate transformierter Zellen.

Fremdmoleküle in Zellen einzuschleusen gehört inzwischen zur Labor-Routine. Bei den üblichen Transformationsverfahren in Zellkulturen fallen jedoch bis zu fünfzig Prozent der Individuen der Prozedur zum Opfer: Sie sterben oder kriegen einen „Entwicklungsknacks“. Als Alternative zur Massenabfertigung kann man die gewünschten Substanzen auch mit feinen Glaspipetten in Einzelzellen injizieren. Bei der klassischen Mikroinjektion entlässt der Experimentator die Flüssigkeit meist durch Druck aus der Pipette ins Zellinnere.

Kultivierte Zellen haben einen Durchmesser von zehn bis zwanzig Mikrometer, Mikropipettenspitzen sind etwa 0,5 bis ein Mikrometer dick. Stellt man sich die Zelle wie eine Dart-Scheibe vor, so wirft der Experimentator bei der Mikroinjektion nicht mit einem feinen Dart-Pfeil auf die Scheibe, sondern mit einem Speer – der entsprechende Schäden verursacht.

Je nach Zelltyp und Rahmenbedingung schwankt die Überlebensrate: Bei menschlichen Blutstammzellen reicht sie zum Beispiel von 9 bis 82 Prozent. Die wenigsten Studien berücksichtigen in ihren Erfolgsquotenberechnungen jedoch die Langzeitüberlebensrate.

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Kein Feedback

Zudem kann man bei der Mikroinjektion unter dem Mikroskop kaum abschätzen, ob die Pipettenspitze bei der Substanzabgabe tatsächlich ins Zellinnere ragt, nur auf der Hülle aufliegt oder bereits aus der gegenüberliegenden Zellmembran herauskommt. Ein unmittelbares Feedback, wie das „Aua!“ eines geimpften Kindes wäre da nicht schlecht.

Simon Hennigs Team aus dem Stall des Bielefelder Spezialisten für Biomolekulare Photonik, Thomas Huser, war das Herumgestochere in den Zellen mit Mikropipetten zu grobschlächtig und ungenau. Seine Gruppe entwickelte eine Nanopipette, die mit 100 Nanometern Durchmesser etwa zehnmal schlanker als Mikropipetten ist (Sci Rep 7: 41277).

Die Bielefelder injizieren die Substanzen auch nicht mit brachialer Gewalt durch Druck in die Zellen, sondern mit einem schonenden elektrophoretischen Verfahren (siehe hierzu auch das Interview mit Simon Hennig auf der nächsen Seite). Für die Nanoinjektion werden Elektroden in dem Medium positioniert, das die Zellen umgibt. Nähert sich die Nanopipette der Zelle, wird eine Spannung von etwa 100 Millivolt angelegt, gleichzeitig misst eine an die Apparatur angeschlossene Software die Stromstärke. Diese fällt sprunghaft ab, sobald die Pipettenspitze das Zellinnere erreicht und die Zelle „Aua“ schreit. Nach diesem Signal wird die Spannung umgepolt und für fünf bis zehn Sekunden auf ein Volt erhöht. Die Nanopipette entleert hierdurch ihren Inhalt ins Cytosol. Anschließend wird sie herausgezogen und ist bereit für die nächste Injektion.

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Die Nanoinjektion verursacht so gut wie keine Schäden an den Zellen. Einen einminütigen Pieks bei 500 oder 1000 mV stecken sie locker weg. Erst nach fünf Minuten bei 1000 mV stirbt etwa die Hälfte der Zellen innerhalb von 24 Stunden. Hennigs Mitarbeiter verfolgten, wie sich die Zellen nach der Nanoinjektion entwickelten; als Kontrollen dienten unbehandelte Zellen. Da die Bielefelder einen nicht-toxischen Dextran-Fluoreszenzfarbstoff (DAF) injizierten, konnten sie behandelte und unbehandelte Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop problemlos unterscheiden. Diffundierte der nicht-membrangängige Farbstoff aus einer Zelle hinaus, wies dies auf eine letale Schädigung der Membran hin. Den endgültigen Beweis hierfür lieferte das gleichzeitige Anfärben mit dem „Todesmarker“ SYTOX Green.

Zellen, die vital blieben, teilten sich auch nach mehr als 24 Stunden weiter, was die Forscher an der Verteilung des applizierten Farbstoffs auf zwei Tochterzellen erkannten. Hennigs Mitarbeiter injizierten hunderte von Zellen mit DAF und beobachteten in regelmäßigen Abständen deren (Mitose-)Verhalten. Verglichen mit der Kontrollgruppe überlebten 92 Prozent den Eingriff (nach 24 Stunden), 81 Prozent der Zellen teilten sich normal.

Injektion direkt in Zellkern

Die hauchdünnen Pipettenspitzen haben aber noch einen weiteren Vorteil: Wahlweise können sie ihren Inhalt einfach ins Zellinnere entlassen, oder aber gezielt und ausschließlich im Zellkern abladen. Auch hier erhält der Experimentator anhand des Stromstärke-Abfalls ein entsprechendes Feedback. Tritt die Pipette durch die Zellmembran, kommt es zum ersten Abfall, dringt sie durch die Kernmembran, sinkt die Stromstärke ein weiteres Mal. Dann heißt es: umpolen, Spannung hochfahren, Pipette entleeren und schließlich hinausziehen.

Mit der Nanoinjektion können Zellforscher Substanzen minimal-invasiv in Zellen einschleusen. Der winzige Pipettendurchmesser hat aber auch Nachteile: Dickes, voluminöses Material passt nicht hindurch. E. coli (3 µm x 0,6 µm) oder Lysosomen (1 µm) können theoretisch eine Mikropipette passieren, eine Nanopipette jedoch nicht.

Folgt nach Mikroinjektion und Nanoinjektion demnächst die Pikoinjektion? Wohl kaum, auch wenn sie noch weniger invasiv wäre. Der minimale Durchmesser von Quarzglaskapillaren liegt bei zehn Nanometern, da wird es für viele Moleküle schon ziemlich eng.




Letzte Änderungen: 14.09.2017


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