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Optischer Fingerabdruck

Raman-Spektroskopie

Irene Doering


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Physiker, Chemiker und Materialwissenschaftler nutzen die Raman-Spektroskopie schon seit Jahrzehnten. Inzwischen begeistern sich auch immer mehr Biowissenschaftler für diese nicht-invasive Technik.

In der letzten Zeit stolperte ich immer wieder über Artikel, die sich mit der Raman-Spektroskopie und ihrer Anwendung in den Biowissenschaften widmeten. Das fand ich zwar spannend, doch Konkretes konnte ich mir darunter nicht vorstellen. Im Hinterkopf hatte ich nur noch, dass diese Methode etwas mit Licht und Streuung zu tun hatte und häufig in den Materialwissenschaften zur Untersuchung „toter“ Materie eingesetzt wird. Als dann einmal wieder etwas Luft war, beschloss ich, mich genauer mit diesem Thema auseinanderzusetzen.

Die Raman-Spektroskopie beruht auf dem Raman-Effekt, der 1928 von seinem Namensgeber Sir Chandrasekhara Venkata Raman entdeckt wurde. Dem indischen Physiker gelang der Nachweis, dass bei der Bestrahlung von Materie mit monochromatischem Licht ein kleiner Teil des gestreuten Lichts eine andere Wellenlänge als das Anregungslicht aufweist. Dafür wurde er 1930 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet.

Das hatte ich also noch richtig in Erinnerung. Doch diesmal wollte ich etwas mehr in die Tiefe gehen.

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Moleküle und ihre Gitter führen Schwingungen aus. Treffen Photonen auf die Moleküle, ergeben sich drei Möglichkeiten. Bei einem „elastischen“ Stoß bleiben sowohl der Energiezustand des Moleküls als auch die Frequenz des Lichtes unverändert. Die hieraus resultierende Rayleigh-Streuung ist um ein Vielfaches stärker, als die beiden anderen Varianten, die auf einem „inelastischen“ Stoß beruhen. Bei diesem ist die ­Schwingungsenergie des Moleküls − und somit auch die Frequenz des Lichtes − vor und nach dem Stoß unterschiedlich.

Dieser Effekt wird als Raman-Streuung (Raman-Effekt) bezeichnet und lässt sich in zwei Fälle unterteilten. Im ersten ist die Schwingungsenergie des Moleküls nach dem Stoß höher, die Frequenz des gestreuten Lichts dagegen kleiner. Da dies gleichbedeutend ist mit einer höheren Wellenlänge spricht man auch von einer Rotverschiebung des Streulichts. Die hieraus resultierenden Spektrallinien nennt man Stokes-Linien.

Im zweiten Fall hat das Molekül Energie an die Photonen abgegeben, wodurch sich die Frequenz des gestreuten Lichts erhöht. Die Wellenlänge ist also kürzer, was zu einer Blauverschiebung führt. Die entstehenden Spektrallinien bezeichnen Physiker als Anti-Stokes-Linien.

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Zwei Forscher untersuchen mit der Raman-Spektroskopie Variante SORS (Spatially Offset Raman Spectroscopy) die Knochendichte.

Spezifische Schwingungen

Treffen die Photonen eines Lichtstrahls auf ein Molekül, verursachen die allermeisten von ihnen aufgrund des Rayleigh-Effekts keine Veränderung des Energiezustands. Nur ein geringer Teil gibt Energie an das Molekül ab oder nimmt Energie von ihm auf. Die hierdurch im Spektrum des Streulichts auftauchenden Stokes- und Anti-Stokes-Linien nutzen Analytiker für die Identifizierung des bestrahlten Moleküls. Da jedes Molekül ganz charakteristische Molekülschwingungen ausführt, ist sein Raman-Spektrum einzigartig wie ein „optischer Fingerabdruck“.

Die technische Umsetzung des Raman-Effekts in Spektrometern ist aber aufgrund des geringen Anteils im Streulicht (was uns dank des stärkeren Rayleigh-Effektes einen blauen Himmel beschert) nicht ganz einfach.

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Ein Raman-Spektrometer besteht aus vier wesentlichen Bauteilen: Einer monochromatischen Lichtquelle, der Probenkammer nebst Sammeloptik, einer Einheit für die spektrale Zerlegung des Lichts sowie einem Detektor. Die ersten Raman-„Spektrometer“ funktionierten noch mit monochromatischem Sonnenlicht als Lichtquelle und dem menschlichen Auge als Detektor. Da die Lichtquelle und der Detektor für den Nachweis der Raman-Streuung eine große Rolle spielen, setzt man heute Laser ein, die eine hohe Photonendichte aufweisen. Die Wellenlänge kann je nach Probe und Fragestellung vom UV- bis hin zum NIR-Spektrum reichen. Filter verhindern, dass die weitaus intensivere Raleigh-Strahlung zusammen mit den Raman-Strahlen auf die empfindlichen Detektoren trifft.

Die klassische Raman-Spektroskopie ist zwar sehr spezifisch, aber nicht besonders sensitiv. Die Eigenfluoreszenz der Probe oder fluoreszierende Verunreinigungen können die Spektrallinien leicht überlagern. Ein weiterer Nachteil ist der Zeitaufwand. Die Belichtungszeiten dauern teilweise Stunden. Forscher suchten deshalb nach Verfahren, mit denen sie die Empfindlichkeit der Raman-Spektroskopie deutlich steigern und gleichzeitig den Zeitaufwand verringern konnten.

Ein Ergebnis hiervon ist die Resonanz-Raman-Spektroskopie (RRS). Bei dieser überführt das einfallende Licht das Probenmolekül zusätzlich in einen elektronisch angeregten Zustand. Die Raman-Streuung intensiviert sich hierdurch um mehrere Zehnerpotenzen.

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Die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) nutzt die starke Verstärkung der Raman-Streuung, wenn die Probe an Metalloberflächen wie Gold, Silber oder Kupfer adsorbiert ist.

Mit zunehmender Leistungsstärke der verwendeten Laser erkannten die Spektroskopiker, dass neben der klassischen, ­linearen Raman-Streuung auch nichtlineare Raman-Effekte auftreten. Diese machten sie sich zunutze und entwickelten hieraus verschiedene nicht-lineare Raman-Spektroskopie-Techniken. Zu diesen zählt unter anderem die kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (Coherent anti-Stokes Raman Scattering, CARS), bei der man zwei Laserstrahlen mit unterschiedlichen Wellenlängen einsetzt. Während die Frequenz des ersten Lasers („Pump-Laser“) konstant bleibt, ist die Frequenz des zweiten Lasers („Stokes-Laser“) einstellbar, meist liegt sie unter der des Pump-Lasers. Beide Laserstrahlen leitet man durch die Probe, wodurch ein laserähnliches, kohärentes Streulicht mit einer verstärkten Raman-Streuung resultiert.

Fokussierter Laserstrahl

Ein weiteres, häufig eingesetztes Verfahren ist die stimulierte Raman-Spektroskopie (stimulated Raman spectroscopy, SRS). Hier wird der Laserstrahl mit einer Linse auf die Probe fokussiert. Ungefähr die Hälfte des einfallenden Lichts produziert eine Stokes-Linie. Die Energie des Lichtes ist jedoch noch ausreichend, um das Molekül weiter anzuregen, woraus eine zweite Stokes-Linie resultiert. Diese Anregungskaskade setzt sich noch einige Male fort und führt so zu einer Verstärkung des Raman-Signals.

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Wo aber liegen die Vorteile der Raman-Spektroskopie in den Biowissenschaften? Was sind mögliche Anwendungen? Und wie müssen Biologen sie adaptieren oder mit anderen Techniken kombinieren, um sie sinnvoll einsetzen zu können?

Für Biologen ist die Raman-Spektroskopie nicht zuletzt deshalb so interessant, weil sie schnell und nicht-invasiv ist. Die Probe ist ohne aufwändige Vorbereitungen für die Raman-Spektroskopie einsetzbar und kann im Anschluss an die spektroskopische Untersuchung weiter analysiert werden. Vorraussetzung ist jedoch, dass eine Datenbank mit Raman-Spektren vorliegt, um das Spektrum der Probe mit den entsprechenden Referenzen abzugleichen.

Raman plus Mikroskop

Biomediziner ergänzen die Raman-Spektroskopie häufig mit der Mikroskopie, um eine möglichst hohe räumliche Auflösung der untersuchten Proben zu erzielen. Ein Beispiel ist die Raman-Mikrospektroskopie. Bei dieser wird das einfallende Licht des Lasers durch das Objektiv auf die Probe fokussiert und zusammen mit dem Streulicht von diesem wieder eingefangen. Durch die vergrößerte Darstellung lassen sich Strukturen abbilden, die kleiner sind als ein Mikrometer.

Zum Einsatz kommt die Raman-Mikrospektroskopie zum Beispiel für den raschen Nachweis von Mikroorganismen. Durch die hohe räumliche Auflösung erhält der Anwender neben dem spezifischen Raman-Spektrum auch eine optische Abbildung der untersuchten Bakterien oder Hefen. Bereits eine einzelne Zelle ist für den Nachweis ausreichend. Um dies auch in komplexen Proben zu gewährleisten, färbt man die Mikroorganismen zusätzlich mit Fluoreszenz-Farbstoffen. Dieses Verfahren, das sich Fluoreszenzfärbung mit anschließender Raman-Mikrospektroskopie nennt, ist inzwischen kommerzialisiert und wird überall dort eingesetzt, wo schnelles Handeln erforderlich ist. Etwa für die Identifizierung pathogener Keime in der medizinischen Diagnostik, aber auch in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.

Bei Viren ist das Ganze etwas komplizierter. Weil sie deutlich kleiner sind, rufen sie einen wesentlich geringeren Raman-Effekt hervor. Mit der SERS-Variante TERS (tip enhanced Raman spectroscopy, spitzenverstärkte Raman-Spektroskopie) in Kombination mit einem Rasterkraftmikroskop gelingt es jedoch auch, Viren nachzuweisen. Mit der Raman-Spektroskopie lassen sich auch Tumorzellen aufspüren, deren Stoffwechsel im Vergleich zu gesunden Zellen verändert ist. Anhand dieser Zellen ist es dann möglich, den Primärtumor und den Grad der Erkrankung zu bestimmen und eine adäquate Behandlung einzuleiten.

Nicht nur für Zellen

Will man Gewebe untersuchen, setzt man die lineare Raman-Spektroskopie zusammen mit der nicht-linearen CARS ein. Die lineare-Raman-Spektroskopie liefert ein vollständiges Raman-Spektrum für jeden Bildpunkt, CARS zeigt das Auftreten einer bestimmten Molekülschwingung innerhalb des Gewebes. Mit diesem Verfahren ist es möglich, gesundes Gewebe von verändertem zu unterscheiden und die Histopathologie sinnvoll zu ergänzen. So gelang es zum Beispiel, bei Darmschnitten eindeutig zwischen den Erkrankungen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa sowie gesundem Gewebe zu unterscheiden.

Erschwert wird die Analyse von Zellen und Gewebe durch die Überlagerung der Spektren aller Zellbestandteile sowie der Spektren von gesunden und pathologischen Zellen. Die Untersuchung wird deshalb mit weiteren Techniken ergänzt, um eine eindeutige Zuordnung sicherzustellen. Die Auswertung erfolgt schließlich anhand statistischer Methoden (chemometrische Modelle).

Kombiniert man die Raman-Spektroskopie mit der Endoskopie, resultiert hieraus die endoskopische Raman-Spektroskopie, mit der die endoskopische Analyse von Geweben möglich ist. Diese Technik wurde bereits für die In vivo-Diagnostik von Tumorerkrankungen eingesetzt und könnte eines Tags auch die Untersuchung von artherosklerotischen Ablagerungen in Gefäßen erlauben. Erste Versuche hierzu wurden bereits an Kleintieren durchgeführt.

Dies sind nur einige Beispiele für die vielen Möglichkeiten, welche die Raman-Spektroskopie Biowissenschaftlern eröffnet. Ihr volles Potential hat sie noch längst nicht ausgeschöpft.






Letzte Änderungen: 14.02.2015


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