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Keine Bange vor der HPLC

Trennen mit Hochdruck

Irene Doering


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Die HPLC- oder UHPLC-Anlage flößt vielen einen gehörigen Respekt ein. Dabei ist ihre Bedienung halb so wild.

Neulich kam ein Kommilitone von mir im Labor vorbei und meinte, er brauche unbedingt meine Hilfe. Ich hatte ihm vor einiger Zeit erzählt, dass ich Trennungen von Substanzgemischen durchführe und diese dann näher charakterisiere. Damals hatte er mich nur ungläubig angesehen, doch jetzt wollte er mehr darüber erfahren − und ich wollte von ihm wissen, woher sein plötzliches Interesse kam.

So erfuhr ich, dass seine Arbeitsgruppe Metaboliten in einem Stoffwechselweg mittels HPLC/Vis quantifizieren und vergleichen wollte. Und natürlich sollten binnen kürzester Zeit Ergebnisse vorliegen. Nur leider stehe er im Moment noch etwas ratlos vor dieser Aufgabe. Und an die neue „Kiste“ in seinem Labor traue er sich auch noch nicht so recht heran − bis ihm einfiel, dass ich doch mal etwas von HPLC gemurmelt hatte...

Ich war sofort dabei, musste ihm aber zunächst ein paar Grundlagen erklären. Mit Hilfe der Chromatografie trennt man Substanzgemische in ihre einzelnen Komponenten. Der Trennmechanismus beruht auf den unterschiedlichen Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären und der mobilen Phase. Die mobile Phase fließt durch die ruhende, stationäre Phase und transportiert das Gemisch durch diese hindurch. Die stationäre Phase retardiert die einzelnen Stoffe mehr oder weniger stark, hält sie also unterschiedlich lange zurück, wodurch sich die Mischung auftrennt.

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Antikörper

Wenn man einige einfache Grundregeln beachtet, ist der Umgang mit HPLC und UHPLC kein Hexenwerk. Foto: Research Lines

Begründer der Chromatografie ist der russische Botaniker Michail Semjonovich Tswett, der bereits 1903 nach diesem Prinzip Blattextrakte in die einzelnen Farbstoffe auftrennte und dies drei Jahre später in einem Aufsatz in den Berichten der Deutschen Botanischen Gesellschaft beschrieb (Tsweet, 24, 316-23).

Aus diesen ersten Versuchen entwickelte sich die Chromatografie rasch weiter. Die Forscher experimentierten mit verschiedenen Materialien wie zum Beispiel Cellulose oder Kieselgel als stationärer Phase. Der „Fluss“ beruhte jedoch stets auf Kapillarkräften (Papierchromatografie, Dünnschichtchromatografie) und/oder der Schwerkraft (Säulenchromatografie), was die Chromatographie häufig zu einer langwierigen Angelegenheit machte. Auch die Bestimmung der Einzelsubstanzen war mit diesen frühen Methoden höchstens halbquantitativ möglich.

Erst mit der in den 60iger Jahren entwickelten High Pressure Liquid Chromatography, beziehungsweise High Performance Liquid Chromatography, kurz HPLC, verkürzte sich die Analysenzeit. Gleichzeitig ließen sich mit der HPLC auch die Analyten exakt quantifizieren. Die mobile Phase fließt hier unter hohem Druck durch eine Säule, die mit dem Trennmaterial oder Sorbens gefüllt ist und als stationäre Phase dient. Vor solch einer HPLC-Anlage stand mein Kommilitone und wusste nicht so recht, wie sie aufgebaut ist, und noch weniger, wie sie bedient wird. HPLC-Anlagen bestehen im Wesentlichen aus den fünf Komponenten: Pumpe, Entgaser (Degasser), Injektor, Trennsäule und Detektor. Die Pumpe fördert die mobile Phase (Fließmittel oder Eluent) unter Druck durch das gesamte System. Zwischen dem Fließmittelvorrat und der Pumpe ist ein Degasser zur Entgasung des Fließmittels geschaltet.

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Simpler Probenauftrag

Der Eluent wird zum Injektor gefördert, dessen Kernstück ein Sechswege-Ventil ist. Befindet sich das Ventil in der Stellung „Load“, fließt die mobile Phase direkt zur Säule. Die Probe wird in eine Dosierschleife (Loop) injiziert, die mit dem Sechswege-Ventil verbunden ist. Schaltet man das Ventil in die Stellung „Inject“, so strömt die mobile Phase durch die Dosierschleife und spült die Probe auf die Säule.

Nach der Trennung erreichen die Analyten zeitlich versetzt den Detektor, der die Signale gegen die Zeit aufzeichnet. Das Ergebnis ist ein Chromatogramm, das am PC ausgewertet wird.

Jetzt wisse er zwar einiges über die Geschichte und den Aufbau der HPLC, warf mein Studienkollege ein, wie das Ganze in der Praxis funktioniere, sei ihm aber noch nicht klar. So widmeten wir uns als nächstes der chromatografischen Trennung, die auf den unterschiedlichen Polaritäten von stationärer und mobiler Phase sowie der Analyten beruht. Nehmen wir an, die Säule ist mit einem apolaren Material gepackt und das Fließmittel ist polar. Injiziert man eine Mischung polarer und apolarer Substanzen, wechselwirken die apolaren stärker mit der stationären Phase und die polaren stärker mit der mobilen Phase. Die polaren Analyten werden also bereits von der Säule gespült, während die apolaren noch von dem Sorbens zurückgehalten werden. Im einfachsten Fall, der isokratischen Trennung, besteht die mobile Phase aus nur einem Eluenten.

Bei komplexen Analyt-Gemischen erleichtert ein Gradient die Trennung. Dazu mischt man mehrere Eluenten unterschiedlicher Polarität während der Analyse in verschiedenen Zusammensetzungen miteinander. In unserem Beispiel startet die Gradientenelution mit einem polaren Eluenten. Die polaren Substanzen verlassen in diesem Fall die Säule, die apolaren werden zurückgehalten. Erhöht man sukzessive den Anteil des apolaren Fließmittels, eluieren nach und nach auch die apolaren Analyten. Verwendet man zwei Eluenten, spricht man von einem binären Gradienten. Das dazugehörige HPLC-System ist dann meist ein binäres System, welches zwei Fließmittel gleichzeitig mischen kann. Es gibt jedoch auch ternäre und quaternäre Systeme, die drei beziehungsweise vier Lösungsmittel miteinander kombinieren.

Mein Kommilitone nickte und wollte schließlich wissen, welche Varianten es neben „apolarer Säule – polarer Eluent“ noch gäbe und wie man herausfindet, welche stationären und mobilen Phasen die jeweils richtigen sind? Damit waren wir dann beim Kern der HPLC-Analytik angelangt.

Unser Beispiel – apolare stationäre Phase und polare mobile Phase – nennt man Reversed Phase (RP)-Chromatografie. Sie entwickelte sich als Umkehrphasen-Chromatografie aus der in der Säulenchromatografie eingesetzten Normalphasen (NP)-Chromatografie mit polarer stationärer Phase und apolarem Eluent.

Spiel mit Polarität

RP-Materialien bestehen meist aus modifiziertem Silica, das heißt an den freien Silanolgruppen des Kieselgels sind (unterschiedlich lange und damit mehr oder weniger apolare) Alkylketten kovalent gebunden. Am häufigsten werden C18-Materialien mit gebundenen Octadecanoyl-Ketten verwendet. Da aus sterischen Gründen nicht alle Silanolgruppen modifiziert sind, sorgen die verbleibenden für eine gewisse Rest-Polarität. C18-Sorbentien decken deshalb ein breites Analyt-Spektrum ab, weshalb die RP-Chromatografie am weitesten verbreitet ist.

Der HPLC-Analytik sind durch die Vielzahl an Sorbentien (fast) keine Grenzen gesetzt. Vorausgesetzt, die Probe ist flüssig und die Analyten sind löslich, detektorgängig und nicht flüchtig. Sind die Eigenschaften der Analyten bekannt, wählt man auf diesen basierend geeignete Säulenmaterialien aus. Die optimale Trennung erfolgt dann über die Zusammensetzung der mobilen Phase. Dabei spielen die Elutionskraft, der richtige pH-Wert und natürlich die Zusammensetzung der mobilen Phase im Falle einer isokratischen beziehungsweise Gradiententrennung die entscheidenden Rollen.

Noch mehr Druck

Das war dann doch etwas viel auf einmal für meinen Studienkollegen. Alles halb so wild, beruhigte ich ihn. Durch die von ihm bereits geleistete Vorarbeit könne er das Säulenmaterial und die in Frage kommenden Eluenten eingrenzen. Alles weitere ist nur noch ein wenig Optimierungsarbeit. Er atmete spürbar auf und wollte dann nur noch wissen, was es mit dem U in der ­UHPLC-Anlage in seinem Labor auf sich habe.

Das U kam erst Anfang dieses Jahrtausends ins Spiel. Bis dahin hatte sich die HPLC technisch nur peu à peu weiterentwickelt. Bessere Trennergebnisse erzielte man überwiegend durch eine Steigerung der Trennleistung der stationären Phasen. Nach der van Deemter-Gleichung, die den mathematischen Zusammenhang zwischen Säulenlänge, Flussrate und Partikelgröße beschreibt, ist eine Steigerung der ­Trenneffizienz vor allem durch die Verringerung der Partikelgröße möglich. Als diese unter 2 µm (sub2µ) rutschte, führte dies zu einem starken „Rückdruck“ der Säulen, dem klassische HPLC-Anlagen nicht mehr gewachsen waren.

Die Hersteller entwickelten daraufhin Ultra High Performance Liquid Chromatography oder UHPLC-Systeme, die ­Rückdrücke bis zu 1300 bar, statt wie bisher 400 bar, standhalten können. Je nach Säulenlänge verkürzt sich mit einem UHPLC-System die Analysenzeit deutlich oder die Trennleistung bei komplexen Proben ist wesentlich höher als bei einer „gewöhnlichen“ HPLC-Anlage.

Als mein Kommilitone erkannt hatte, welches Potential in seiner „UHPLC-Kiste“ steckt, hellte sich seine Miene deutlich auf. Er verabschiedete sich schließlich voller Tatendrang mit dem Hinweis, dass er gleich mal testen wolle, ob seine UHPLC-Anlage binär oder quaternär ist.






Letzte Änderungen: 02.10.2014


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