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Mikroplatten-Material beeinflusst Proteasom-Assays

Mikroplatten Roulette

Thorsten Lieke


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Biowissenschaftler müssen bei ihren Versuchen ständig auf der Hut sein. Selbst das verwendete Plastikmaterial kann sie aufs Glatteis führen.

Biowissenschaftler verlassen sich häufig auf kommerzielle Kits, um Enzymaktivitäten, Proteininteraktionen und Konzentrationen zu bestimmen oder Biomoleküle aufzureinigen. Mit den Kits kauft man auch das Vertrauen ein, dass die erzielten Resultate verlässlich sind. Die Kit-Hersteller arbeiten deshalb permanent daran, Störfaktoren zu eliminieren, Nachweisgrenzen zu verbessern, Hintergrundrauschen zu minimieren oder Reaktionszeiten zu verkürzen. Da gerät das Alltägliche leicht aus dem Blick und man übersieht oft ganz banale Fallen: zum Beispiel die Auswirkungen der verwendeten Reaktionsgefäße aus Plastik auf das jeweilige Experiment.

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Mikrotiterplatten unterscheiden sich nicht nur in der Zahl der Wells, sondern auch im verwendeten Plastikmaterial. Wie stark dieses die Ergebnisse von Proteasom-Assays verfälschen kann, musste eine amerikanische Gruppe erfahren.

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Welche Platte passt am Besten?

Dass Proteine, Peptide oder DNA sehr gerne an Plastik binden, weiß man schon länger. So berichtete zum Beispiel 2011 eine Gruppe um Miriam Goebel-Stengel, dass Peptide durch Adhäsion an die Oberfläche der verwendeten Reaktionsgefäße aus Plastik im Verlauf einer Reaktion regelrecht verloren gehen können (Laborjournal 7-8/2011, Seite 56).

Dass das verwendete Plastikmaterial auch einen direkten Einfluss auf Versuchsergebnisse haben kann, stellte die Gruppe von Aldrin Gomes an der University of California fest (Cui et al., Anal. Biochem., 446, 44-52). Eigentlich wollte Gomes nur herausfinden, welche Mikrotiterplatte am Besten zu seinem Proteasom Assay-Kit passt. Eine Fragestellung, die bei vielen Kits auftaucht. Einige werden mit allem Drum und Dran einschließlich Mikrotiterplatten angeboten, andere enthalten nur die Reagenzien und den Puffer, die Platten muss man sich selbst besorgen.

Für seinen Proteasom-Aktivitätstest isolierte Gomes zunächst Proteasomen aus den Lebern und Herzen von Ratten. Zu diesen gab er 7-Amino-4-Methylcoumarin-(AMC)-markierte Peptide, die entsprechend der unterschiedlichen proteolytischen Aktivität des Proteasom-Komplexes (Caspase-, Trypsin- und Chymotrypsin-ähnliche Aktivität) gespalten werden. Die Fluoreszenz des freigesetzten AMC mass er schließlich mit einem Mikroplatten Fluorometer. Hierbei verwendet man in der Regel schwarze Mikrotiterplatten, die keine Autofluoreszenz zeigen, die Seitenstrahlung von Well-zu-Well minimieren und zudem auch das Streulicht absorbieren. Gomes testete Platten von Greiner (Fluorotrac 200, mit mittlerer Bindungsstärke; Fluorotrac 600, mit hoher Bindungsstärke) sowie eine Platte von Costar mit mittlerer Bindungsstärke und eine nicht-bindende Platte von Corning. Die Gruppe pipettierte in alle Platten identische Reaktions-Ansätze und analysierte anschließend die Proteasom-Aktivtät.

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Erratische Ergebnisse

Dass es aufgrund der verschiedenen Bindungseigenschaften der getesteten Mikrotiterplatten Unterschiede in den Resultaten gab, kann man sich denken. Aber – und das ist das verflixte – die Unterschiede waren nicht einheitlich. Gomes fütterte die isolierten Proteasomen mit verschiedenen Peptiden, die auf die spezifischen Untereinheiten des proteolytischen Apparates zugeschnitten waren. Wer jetzt erwarten würde, dass er in der nicht-bindenden Platte durchgehend die höchsten proteolytischen Aktivitäten fand, sieht sich getäuscht. In dieser war nur die Caspase-ähnliche Aktivität der Proteasomen am höchsten, die Trypsin-ähnliche Aktivität glich hier einer Berg-und-Tal-Fahrt. Die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität unterschied sich dagegen in den Platten mit mittlerer Bindungsstärke von Greiner und Costar signifikant.

Diese Ergebnisse gelten jedoch nur für Proteasomen, die aus den Herzen der Ratten isoliert wurden. Bei Proteasomen aus der Leber sahen sie wiederum anders aus. Bei diesen war die proteolytische Aktivität in den Platten mit nicht-bindenden Eigenschaften dramatisch reduziert. Bei den aus dem Herzen isolierten Proteasomen hatte die Gruppe in diesen noch die höchste proteolytische Aktivität gemessen.

Angespornter Ehrgeiz

Die bis hierhin erzielten Resultate spornte die Gruppe zu weiteren Experimenten an. Sie erstellte Standard-Kurven und setzte ihren Ansätzen Inhibitoren oder Proteolyse-verstärkende Reagenzien zu, etwa Betulinsäure, das die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität erhöht. Die hieraus resultierenden Versuchergebnisse erwecken eher den Eindruck, als seien sie in einem Flipperautomaten generiert worden als durch sorgfältiges Pipettieren zustande gekommen. Mal sprangen die Messwerte in der einen Platte in die Höhe, mal in der anderen. Und schon die kleinste Veränderung in der Versuchsdurchführung konnte das Ganze wieder auf den Kopf stellen.

Um die Sache nicht dramatischer zu machen als sie ist: In den allermeisten Fällen waren die Unterschiede eine Frage der Stärke der Aktivität. Das heißt, die Tendenz ging in den unterschiedlichen Mikrotiterplatten in die gleiche Richtung, nur die gemessene Fluoreszenz-Intensität als Maß für den Peptidverdau variierte stark.

Im Fall der Betulinsäure-Verstärkung war die Auswirkung des Plastikmaterials auf den Versuch aber dennoch gravierend. In den mittleren und hoch-bindenden Platten erhöhte sich die Proteolyse-Aktivität durch die Zugabe von Betulinsäure. In der nicht-bindenden Platte von Corning konnten Gomes et al. keinerlei Unterschied zwischen Experimenten mit und ohne Betulinsäure feststellen. Hier führte die Art des Plastikmaterials tatsächlich zu komplett unterschiedlichen Ergebnissen.

Was ist die Konsequenz?

Was sagt uns diese Veröffentlichung? Hängen Experimente vom „richtigen“ Plastikmaterial ab? Muss man in langen, Gelder verschlingenden Versuchsreihen testen, welche Reaktionsgefäße sich für den jeweiligen Versuch eignen und wie die Versuchsergebnisse von der Plastikmarke abhängen? Wo fängt man an, bei Falcon-Röhrchen, Eppendorf-Gefäßen, Petrischalen?

Wenn man das Internet zu diesem Thema befragt, schweigt es seltsam stille. Es sieht so aus, als hätte sich die Forschergemeinde darauf geeinigt, dass nicht jeder theoretisch denkbare Einfluss auf Versuche und Ergebnisse unter die Lupe genommen werden muss.

Selbst Aldrin Gomes und seine Kollegen vermeiden im Diskussions-Teil des Papers, die schlimmste Konsequenz aus ihrer Studie auszusprechen: dass nämlich Versuche, die in industriell hergestellten Reaktionsgefäßen aus Plastik stattfinden, nicht zwingend die tatsächlichen biologischen, chemischen oder physikalischen Prozesse in der Zelle widerspiegeln. Das sollte aber auch jedem Biowissenschaftler von vorne herein klar sein.



Letzte Änderungen: 13.02.2014


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