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Zellfreie Proteinsynthese

Konzentration auf das Wesentliche

Marlitt Stech, Doreen Wüstenhagen & Stefan Kubick


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Manchmal ist es besser, Zellen in Stücke zu zerlegen, bevor man sie für die ­Expression von Proteinen einsetzt.

Bei der klassischen In-vivo-Überexpression bringt man die lebende Zelle dazu, neben ihren eigenen, überlebenswichtigen Proteinen, auch noch ein fremdes Protein zu produzieren. Die Ressourcen der Proteinsynthesemaschinerie werden hierdurch auf alle neu zu synthetisierenden Proteine aufgeteilt, was wiederum die Expressionsrate des gewünschten Proteins reduziert.

Aber selbst wenn die Überexpression beispielsweise in E. coli glückt: wer hat nicht schon damit gekämpft, sein kostbares Protein aus den entstandenen Einschlusskörpern (Inclusion Bodies) herauszulösen? Wenn man das Protein dann endlich in den Händen hält, ist die Aktivität oft stark ­herabgesetzt oder gar nicht vorhanden. Im schlimmsten Falle vergiftet das exprimierte Protein die Zelle und tötet sie schon während der Überexpression. Anders bei der zellfreien Proteinsynthese, die die Gruppe um Stefan Kubick am Fraunhofer IBMT in Potsdam-Golm verwendet. Bei dieser synthetisiert die Proteinsynthesemaschinerie der Zelle nur ein einziges neues Protein und verschwendet keine Ressourcen für die Translation anderer Proteine.

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Exprimieren ihre modifizierten Proteine in zellfreien Proteinsynthese-Systemen: Doreen Wüstenhagen (l.), Stefan Kubick und Marlitt Stech vom Fraunhofer IBMT in Potsdam-Golm.

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Wie bei klassischen Expressionssystemen kultiviert man die Zellen auch bei zellfreien Systemen in einem Fermenter und erntet sie, sobald sie ihre produktivste exponentielle Wachstumsphase erreicht haben. Das Zelllysat, das man nach dem Aufschluss der Zellen und der Entfernung des Zellkerns sowie der Zellmembran erhält, ist schon fast für die gezielte Translation des gewünschten Proteins geeignet. Man muss nur noch alle endogenen mRNAs entfernen. Die Zelllysate würden sonst neben dem Zielprotein auch zelleigene Proteine synthetisieren.

Just-in-Time Produktion

Die Lysate kann man anschließend in aktiver Form einfrieren und über Jahre hinweg ohne Verlust der Translationsleistung lagern. Braucht man sie, so taut man sie auf, versetzt sie mit Puffern sowie DNA und produziert mit ihnen „Just-in-Time“ das gewünschte Protein. Prinzipiell ist jede Zelllinie für die Herstellung ­zellfreier Proteinsynthesesysteme geeignet. Entscheidend für die Wahl des Systems ist aber das herzustellende Protein. Bei einem humanen Protein ist zum Beispiel ein Lysat aus kultivierten menschlichen Zellen am geeignetsten, das die notwendigen Kofaktoren und Faltungshelfer (Chaperone) bereits enthält. Ist dieses Protein jedoch endogen in der Zelle und damit im Lysat vorhanden, kann es den Aktivitätsassay stören. In diesem Fall muss man auf Systeme ausweichen, die nicht auf Säugerzellen basieren. Zu diesen zählen zum Beispiel Lysate aus Insektenzellen oder auch pflanzliche Systeme aus Weizenkeimextrakten.

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Die notwendigen Arbeitsschritte von der DNA zum Protein kann man ohne Klonierungen und Transformationen durchführen. Die direkt in das offene zellfreie System pipettierte lineare Template-DNA wird innerhalb von 60 bis 90 Minuten in sogenannten gekoppelten Transkriptions-Translationssystemen ohne zeitaufwendige Klonierungsschritte translatiert.

Mit der zellfreien Proteinsynthese kann man neben unterschiedlichsten Proteinen insbesondere auch Antikörper herstellen, die sowohl bei der Diagnostik, als auch in der Therapeutik eine immer größere Rolle spielen. Im Gegensatz zu den etablierten Methoden der Antikörperherstellung, wie zum Beispiel der Hybridomatechnologie, sind hierbei keine Tierversuche nötig. Da die zellfreien Proteinsynthese-Reaktionen, ausgehend von Nanolitern bis hin zu mehreren Litern Reaktionsvolumen skalierbar sind, eignet sich diese Methode besonders zur parallelen Herstellung von ­Antikörpern.

Aktuelle Forschungsergebnisse belegen, dass man mit eukaryotischen Zelllysaten funktionell aktive Antikörperfragmente herstellen kann. Im Gegensatz zu Antikörperfragmenten, die mit prokaryotischen Zelllysaten produziert wurden, sind diese nicht mit Endotoxinen kontaminiert und eignen sich auch für die Anwendung in Zellkulturen oder zu therapeutischen ­Zwecken.

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Mit dem gelb-fluoreszierenden Protein (eYFP) fusionierte Membranproteine sammeln sich in den Lipid-Vesikeln des Zelllysats.

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Kleine Protein-Container

Mit besonders milden Zellaufschlussmethoden kann man eukaryotische Zelllysate generieren, die mikrosomale Vesikel enthalten, also funktionell intakte Strukturen des endoplasmatischen Retikulums. Die zellfrei synthetisierten und sekretierten Proteine sammeln sich im Inneren der Vesikel oder im Fall von Membranproteinen in der Vesikelmembran. Die Vesikel funktionieren wie „Protein-Mikro-Container“, in denen im nächsten Schritt eine posttranslationale Modifizierung der Proteine erfolgt.

Wie bei lebenden Zellen werden die Zielproteine im Inneren der Vesikel modifiziert. Bei Antikörpern sind dies zum Beispiel stabilisierende Disulfidbrücken, die einen entscheidenden Einfluss auf die Faltung und Funktionalität der Antikörperfragmente haben.

Reichert man die Vesikel an, so kann man neu synthetisierte Antikörperfragmente mit ihnen konzentrieren und reinigen. Und wie führt man mit den Antikörperfragmenten, die in den Vesikeln verborgen sind, Funktionsanalysen durch? Nichts leichter als das, denn die Vesikel bestehen zum großen Teil aus Lipiden, die man bereits mit milden Detergenzien knacken kann. Die Antikörperfragmente haben dann freie Bahn und können in das umliegende Milieu diffundieren. Auf diese Weise sind direkte Bindungsstudien und Antikörper-Funktionsanalysen ohne weitere Aufreinigungsschritte möglich.

Die zellfrei hergestellten Proteine lassen sich auch mit neuen Eigenschaften versehen, die für weitergehende technologische Anwendungen interessant sind. So kann man etwa fluoreszierende Aminosäuren bereits während der zellfreien Synthese gezielt in Proteine einbauen, um sie auf Chip-Oberflächen detektieren zu können.

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Letzte Änderungen: 05.12.2013


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