Info

Drei auf einen Streich

2D-Elektrophorese-Western-Blot-Protokol

Christoph-Martin Geilfus


Info

Info

Accelerate your research with custom monoclonal and polyclonal antibodies from BioGenes. mehr

Die Trennung von Isoprotei­nen­ via 2D-Gelelektrophorese und anschließendem Western Blot verschlingt viel Zeit und Geld. Mit einem cleveren Trick kann man das Verfahren jedoch beschleunigen und die Qualität der erzielten Daten verbessern.

Wenn Biowissenschaftler abschätzen wollen, wie sich die Proteinmengen in einer Zelle verteilen, führen sie meist einen Enzymimmunoassay oder Western Blot durch. Dazu trennen sie die Proteine per Gelelektrophorese, übertragen sie auf eine Membran und detektieren sie schließlich mit enzymgekoppelten Antikörpern. Das ist altbewährte Laborroutine und funktioniert in der Regel problemlos. Hat man es aber auf Isoformen einzelner Proteine abgesehen, stößt man oft auf methodische Schwierigkeiten. Primäre Antikörper herzustellen, die eine der Isoformen spezifisch binden, ist (sofern es überhaupt gelingt) meist mühsam und teuer, weil sich Isoformen häufig nur minimal unterscheiden.

Man trennt die Proteine deshalb meist mit einer zweidimensionalen Gelelektrophorese vor der Immunodetektion. Das hat den Vorteil, dass man dann einen Primärantikörper verwenden kann, der die gewünschte Proteinfamilie spezifisch bindet, aber innerhalb dieser nicht diskriminieren muss. Die einzelnen Isoformen identifiziert man anschließend im Massenspektrometer oder unterscheidet sie über das Molekulargewicht oder den isoelektrischen Punkt.

Elektroblotter und Multilaufkammer


Stephanie thor Straten und Christoph-Martin Geilfus mit den beiden wichtigsten Requisiten der 2D-PAGE-Western-Blot-Analyse, dem Elektroblotter und der Multilaufkammer, die sechs Gele aufnehmen kann. Mit letzterer lassen sich 18 Proteinproben gleichzeitig analysieren.

Info

Info

INTEGRA entlastet Sie von Routine-Pipettier­arbeiten und sorgt für hervorragende Ergeb­nisse beim Pipettieren. mehr


Viele Fehlerquellen

Theoretisch sollte man so die einzelnen Isoformen problemlos finden, es sei denn, man arbeitet mit Isoformen, die nur in sehr geringen Mengen im Gewebe vorliegen (schwach-abundante Proteine). Auf Grund verschiedener methodischer Schwierigkeiten führt dies oftmals zu einer Variabilität der Daten, und auch andere Fehlerquellen verschlechtern die Reproduzierbarkeit. So findet zum Beispiel jede Elektrophorese und die nachgeschaltete Immunoblotting-Prozedur unter­ leicht unterschiedlichen Bedingungen statt. Dabei kann zum Beispiel die Qualität oder das Alter der SDS-Gele variieren, die Form der Filterpapiere des Western-Transferblockes, die Zeit des Proteintransfers vom Gel auf die Membran, die Stärke des Kontaktes zwischen Gel und Membran, die Qualität und Verdünnung des Antikörpers, das Waschen der Membran oder aber die Detektion der Signale.

Um diese Fehlerquellen so weit als möglich auszuschalten, sollte man alle zu vergleichenden Proteinextrakte in einem gemeinsamen Western Blot-Durchgang analysieren (Christoph-Martin Geilfus, Karl H. Mühling, Christian Zörb; A methodical approach for improving the reliability of quantifiable two-dimensional Western blots; J.Immunol. Methods; In Press; doi:10.1016/j.jim.2010.09.006). Das funktioniert folgendermaßen: Will man zum Beispiel zwei Proteinextrakte mit jeweils drei Wiederholungen vergleichen, fokussiert man die Proteinextrakte im ersten Schritt der 2D-Elektrophorese gemeinsam und zeitgleich in einem Fokussierungsmagazin auf den IPG-Strips. Danach kürzt man die IPG-Strips an den Rändern mit einer Schere, so dass drei IPG-Strips nebeneinander auf nur einem SDS-Gel Platz finden.

Info

Info

Wir alle tun es – und das ziemlich oft! Drücken die Taste und dann passiert es... mehr


Weniger Arbeit

So lassen sich drei (oder mehr) Proteinextrakte nebeneinander auf demselben SDS-Gel in der zweiten Dimension auftrennen (siehe Abbildung) und man verhindert Abweichungen innerhalb der Wiederholungen, die auf Qualitätsunterschiede der Gele zurückzuführen sind. Darüber hinaus reduziert sich der Arbeitsaufwand, weil man anstelle von sechs 2D-Gelen nur noch zwei beaufsichtigen muss. Verwendet man IPG-Strips, die über einen weiten pH-Bereich auftrennen (pH 3-11) in Kombination mit einem großen SDS-Gel (zum Beispiel 20 cm), können auch Isoformen untersucht werden, die weit voneinander entfernt liegen.

Aus den beiden SDS-Gelen schneidet man anschließend (großzügig) jeweils das Gelstück aus, das die aufgetrennten Isoformen enthält (hierbei kann man sich an einem Prestained-Proteinmarker orientieren). Die beiden Gelstücke legt man nebeneinander auf eine Blotting-Membran und transferiert die Isoformen von dem Gel auf die Membran. Danach detektiert man die auf der Membran immobilisierten Proteine mit Antikörpern. Auf diese Weise behandelt man die Isoformen aus sechs Proteinextrakten identisch und eliminiert verschiedene Fehlerquellen, wodurch sich sowohl die Reproduzierbarkeit als auch die Datenqualität verbessern. Mit einer Multi-Laufkammer, die bis zu sechs 2D-SDS-Gele aufnehmen kann, haben wir mit dieser Methode schon 18 Proteinextrakte in einem Lauf analysiert. Alle zweidimensional aufgetrennten Isoformen immobilisierten und detektierten wir dabei auf einem einzigen Membranstück.

Schematische Darstellung der modifizierten 2D-SDS-PAGE


Schematische Darstellung der modifizierten 2D-SDS-PAGE. Die IPG-Strips werden an den Rändern so gekürzt, dass drei IPG-Strips (z.B. à 6 cm) nebeneinander auf einem SDS-Gel (z.B. 20 cm) platziert werden können. Auf diese Weise kann man pro SDS-Gel drei elektrofokussierte Proteinextrakte auftrennen. Die Proteine sind zu diesem Zeitpunkt in Wirklichkeit noch nicht zu sehen, weil sie nicht angefärbt wurden. Der rote Rahmen kennzeichnet die Proteine des SDS-Geles, die man auf die Western-Blot-Membran transferiert. Weil alle SDS-Gel-Fragmente nur sehr klein sind, können sie auf einem einzigen Membranstück angeordnet werden.



Fazit: Durch die simultane Analyse der Proteinextrakte spart der Laborant Zeit und der Chef muss weniger Geld für 2D-PAGE- und Immunoblotting-Reagenzien sowie teure Antikörper ausgeben. Zudem erzielt man deutlich zuverlässigere Ergebnisse. Übrigens: Mehrere IPG-Strips auf ein SDS-Gel zu platzieren lohnt sich für sämtliche 2D-PAGE-Ansätze.


Letzte Änderungen: 23.12.2010


Info

Info

Mit dem HandyStep® Touch bringt BRAND® den Touchscreen auch für handgehaltene Geräte ins Labor. mehr

Info
Info
Diese Website benutzt Cookies. Wenn SIe unsere Website benutzen, stimmen SIe damit unserer Nutzung von Cookies zu. Zur ausführlichen Datenschutzinformation