Schwimmende Kunstharzfilme

Befilmen von Transmissions-Elektronenmikroskopienetzchen

Patrick Heidrich

Die Präparation von Objektträgern für die Elektronenmikroskopie ist eine Wissenschaft für sich, die viel Fingerspitzengefühl verlangt. Umso wichtiger ist es, die handwerklichen Kniffe zu kennen.

Als Netzchen bezeichnet man in der Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) netzartige Objektträger aus Kupfer, Nickel, Gold oder anderen Werkstoffen. Um Proben im TEM zu mikroskopieren, werden sie in Scheibchen geschnitten, auf die Netzchen aufgezogen und in den Strahlengang eingebracht. Dickere Ultradünnschnitte (Ultras) von in Kunstharz eingebetteten Proben können direkt auf der Netzoberfläche aufgezogen werden. Bei den häufig vorkommenden dünneren Schnitten (ca. 50-100 nm) werden die Netzchen vor Gebrauch mit einer Trägerfolie beschichtet, die die Ultras mechanisch stabilisiert. Im Jargon: die TEM-Netzchen werden befilmt. Leider befilmen sich die Netzchen nicht von alleine.

Reiche Labors ordern fertig befilmte Netze von Zulieferern. Oder man „leiht“ aus den Beständen der Nachbarn. Aber was tun, wenn die nette TA oder der Doktorand, von denen man sich immer befilmte Netzchen „leihen“ konnte, im Urlaub weilen und die Vorräte verbraucht sind. Befilmen Sie selbst! Die handwerklichen Kniffe finden Sie hier.

Es existieren diverse Vorschriften zur Befilmung von Netzchen. „Oral tradierte“ Rezepte erweisen sich oft als wertlos, da der entscheidende Kniff vergessen oder unterschlagen wurde. Darum entwickelte ich zusammen mit Kollegen die folgende Arbeitsvorschrift:

1. Die Glasobjektträger (=Träger) werden zunächst gründlich gereinigt.
2. Anschließend beschichtet man sie mit einem in Chloroform oder anderen leicht flüchtigen Lösungsmitteln gelösten Kunstharz (Butvar, Formvar, Pioloform, etc.).
3. Die beschichteten und getrockneten Träger werden durch Ritzen präpariert, die Kunstharzfolien vom Objektträger abflottiert und die Netze auf diese Trägerfolien aufgebracht.
4. Die an der Trägerfolie haftenden Netzchen werden mit einem Parafilmträgerstreifen aufgenommen und getrocknet.

Nicht trivial

Diese Teilschritte mögen trivial erscheinen, aber sie sind es nicht: Tricks und Kniffe entscheiden, ob die Netzchen etwas taugen, oder der Nachmittag unter „Lebenserfahrung“ verbucht werden muss.

Zu Schritt Eins: Sie haben die Wahl zwischen verschiedenen Typen von Glasobjektträgern. Bei Trägern mit rundgeschliffenen Rändern soll sich die Folie an den Rundungen leichter vom Glas trennen. Ich habe mit diesem teuren Material schlechte Erfahrungen gemacht und verwende zum Beschichten meist die „normalen“ Träger (geschnitten, gewaschen, 76 x 26 mm), wie sie in jedem histologischen Labor zu finden sind. Gereinigt wird teils drastisch mit starken Säuren und/oder potenten organischen Lösungsmitteln. Ich wasche die Träger nur mit warmem bidestilliertem Wasser und Chloroform in Färbetrögen. Nach der Reinigung werden die gesäuberten Objektträger „kontrolliert wieder verschmutzt“. Dazu verwende ich einen Lappen aus einem alten, gewaschenen Laborkittel (Baumwolle) und wische damit die Träger mit sanftem Fingerdruck. Keine Handschuhe! Das vom Gewebe aufgenommene Fingerfett soll während des Reibens gleichmäßig in die Glasoberfläche „einmassiert“ werden. Beim Reiben die seitlichen Flächen des Trägers nicht vergessen. Der dünne Fettfilm erleichtert das Ablösen des Kunstharzfilms vom Glasträger. Falls der Lappen noch nicht ausreichend „imprägniert“ ist, kann durch direktes Anfassen der Objektträger mit den bloßen Fingern eingefettet werden.

Zu Schritt zwei: Beschichtet wird mit 0,5-1%igen Lösungen der Kunstharze in Lösungsmittel unter dem Abzug. Ich verwende 0,5% (w/v) Pioloform in Chloroform. Die Lösung wird in einen Färbetrog gegeben, die Objektträger, bis auf einen ca. 1,5-2 cm langen Randbereich, der unbeschichtet bleibt (vgl. Abb. 1, Links), eingesenkt und dann mit gleichmäßiger Geschwindigkeit aus der Lösung gezogen. Die Verweildauer in der Chloroformlösung sollte 2-4 Sekunden nicht überschreiten. Die Gleichmäßigkeit der Bewegung bestimmt die Qualität des sich niederschlagenden Films. Bei ungleichmäßiger Bewegung bildet der Film Wellen. Vermeiden Sie während der Beschichtung flusige Textilien sonst setzen sich Schwebstoffe auf der frisch gezogenen Folie ab und führen zu Artefakten. Die beschichteten Träger lassen sich lagern oder sofort weiter verwenden.

Zu Schritt drei: Vor dem „Abflottieren“, dem Ablösen der Folie vom Träger mittels Wasser, muss der Träger präpariert werden. Dies geschieht durch „Ritzen“, das heißt der Film wird an definierten Stellen zerstört. Einige Protokolle raten zum Ritzen am Rande der Träger, andere ritzen in Randnähe auf der Glasoberfläche. Ziel ist es, die Kantenbereiche der Folie, die sich nur schwer vollständig ablösen lassen, von den großen Folienflächen zu isolieren. Um zu prüfen, wo schon geritzt wurde, kann man den Träger anhauchen. Die Ritze werden dann als spiegelnde Linien auf mattem Hintergrund sichtbar. Geritzt wird mit Nadeln, Rasierklingen oder Skalpellen (vgl. Abb. 1, links). Beim randnahen Ritzen von Standardträgern (geschnitten) bildet sich an deren Kanten Glasstaub. Die Kontamination der Trägerfolie mit Glasstaub lässt sich durch Arbeiten innerhalb eines gerichteten Luftstromes minimieren.

Wie löst man die gezogene und geritzte Folie vom Träger ab? Alle Methoden bedienen sich des gleichen Tricks, dem Aufschwimmen auf einer Wasseroberfläche. Ich fülle dazu eine große Petrischale (Durchmesser > 20 cm, Tiefe > 5 cm, in einer Schale stehend) mit bidestilliertem Wasser, bis sich ein Meniskus über den Glasrand hebt. Dafür muss die Schale vorher mit einer Wasserwaage nivelliert werden. Nun wird die Schale mit einem langen Glasstab oder Lineal über Rand zu Rand „gestrichen“, um an der Wasseroberfläche treibende Staubpartikel zu entfernen. Vorsichtig wird anschließend der Wasserspiegel durch Zugabe von bidestilliertem Wasser mittels einer Spritzflasche wieder erhöht und das Abflottieren kann beginnen.




Wandernder Wasserfilm

Der beschichtete Träger wird mit der homogener erscheinenden Seite zur Wasserfläche im spitzen Winkel mit dem unbeschichteten Randbereich an die Kante der Petrischale angesetzt. Vorsichtig wird nun der Winkel abgeflacht, bis die Wasserfläche den Träger berührt und einen konkaven Meniskus ausbildet (Abb. 1, Mitte). Durch vorsichtiges weiteres Abwinkeln des Trägers erreicht man, dass der Wasserfilm am Träger hinaufwandert, bis er die Zone des geritzten Trägerfilms erreicht. Der Wasserfilm „kriecht“ zwischen die Trägerfolie und den Objektträger und trennt diese dabei voneinander (vgl. Abb. 1, Detail, mitte). Idealerweise schwimmt die Trägerfolie auf der Wasseroberfläche auf, während das Trägerglas in der Schale versinkt.

Entscheidend für das Beobachten und Kontrollieren dieses schwierigen Schrittes ist die Beleuchtung. Vermeiden Sie diffuses Licht. Arbeiten Sie mit einer oder mehreren punktförmigen Lichtquellen, die Sie positionieren, bis Sie die abflottierte Folie gut sehen können. Ein zugfreier Arbeitsplatz ist von Vorteil, da die schwimmende Folie beim leisesten Hauch anfängt, unkontrollierbar weg zu driften.


Bunte Folien in den Müll

Folien, die schon auf dem Wasser deutlich sichtbar sind, können Sie verwerfen. Sie sind für „normale“ Anwendungen zu dick. Hier ist die Dickenabschätzung mittels Interferenzfarben nützlich. Trennt sich die Folie erst gut vom Träger ab, bleibt dann aber an der Kante des abtauchenden Glases haften und wird von diesem mit in die feuchten Tiefen gerissen, haben Sie schlecht geritzt oder der Glasträger war in diesem Bereich zu unsauber.

Die schwimmende Trägerfolie wird nun mit gereinigten Netzchen belegt, welche mit der dunkleren Seite nach unten nebeneinander plaziert werden. Achten Sie darauf, dass die Netzchen nicht zu weit voneinander oder zu nah aneinander plaziert sind. Bei letzterem hat die Folie zwischen den Netzen keinen Kontakt mehr zum Parafilm mit der Folge, dass sich beim Aufnehmen ganze Netzchengruppen unkontrolliert ablösen.

Ist die Folie fertig belegt, schneiden Sie ein Stück Parafilm passend zur Größe der schwimmenden Folie aus und plazieren dieses mit der „sauberen“ Seite nach unten über der schwimmenden Folie. Dann senken Sie das Parafilm an einer Kante ab, bis die schwimmende Folie in plötzlichen Kontakt mit dem Wachs tritt (vgl. Abb. 1, rechts). Durch weiteres rollendes Absenken schmiegt sich die gesamte Folie an den Parafilmstreifen, haftet dort und kann vorsichtig durch Abziehen der Folie von einer Seite her von der Wasseroberfläche abgetrennt werden. Abschließend werden diese „Parafilm-Netzchen-Trägerfolie“-Sandwiches in Petrischalen mit Nocken gelegt, um dort staubfrei zu trocknen. In diesen Schalen werden sie auch gelagert, bis Ultras mit ihnen aufgenommen werden oder der Benchnachbar Zins und Zinseszins zurückfordert. Fragen und Anregungen an patrick.m.heidrich@web.de.




Letzte Änderungen: 16.11.2009