CRISPR-Cas war gestern, jetzt kommt Basen-Editing. Damit kann man gezielt einzelne Basen verändern, statt größere Mutationen einzuführen. Die Papierform des Basen-Editings ist bestechend.
Neue Verfahren etablieren sich sehr schnell in Life Science-Laboren, wenn sie funktionieren und Vorteile bieten. Das hat man zuletzt bei CRISPR-Cas gesehen. Der nächste Kandidat, der eine ähnlich steile Karriere hinlegen könnte, ist Basen-Editing. Dafür sprechen sowohl die elegante Idee als auch die bisherigen Ergebnisse. Atemberaubend ist auch die Geschwindigkeit, mit welcher der erste Basen-Editor, der Cytosin in Uracil überführt (C zu U), den Review-Prozess durchlief: Am 26. Feburar 2016 ging das entsprechende Manuskript von Alexis Komor et al. bei Nature ein, am 20. April war es bereits online (551: 464-71) – das ist rekordverdächtig.
Das Basen-Editing tüftelten David Ruchien Liu und seine Mitarbeiter vom Broad-Institut in Cambridge, USA, aus. Sie kombinierten CRISPR-Cas-Komponenten mit Bestandteilen der mRNA-Editiersysteme, die sowohl Pro- wie auch Eukaryoten benutzen. Liu fasste die Methode in einer Presseerklärung so zusammen: „Wir haben programmierbare molekulare Maschinen entwickelt, die an einer von uns ausgewählten Stelle im Genom eine Base austauschen, ohne dabei einen Doppelstrangbruch in die DNA einzufügen.“
Gibt es denn ein Problem mit dem Doppelstrangbruch? In der Tat. Die heute als Gen-Editier-Systeme benutzten CRISPR-Cas-Varianten lösen an der Zielstelle, die durch die Sequenz der Guide-RNA definiert wird, einen Doppelstrangbruch aus. Diesen repariert die Zelle meist durch End-Joining-Prozesse, was zum Verlust oder zur Insertion mehrerer Basenpaare führt. Statt einer präzisen Reparatur erhält man eine Mixtur mutierter Varianten. Das ist okay, wenn man das betreffende Gen einfach ausschalten will. Möchte man aber eines reparieren, wird’s schwierig.
Oftmals wird aber eine Reparatur angestrebt, denn Punktmutationen sind die Ursache vieler Krankheiten. Und auch für die Forschung sind präzise und schnelle Editier-Verfahren sehr nützlich. Die neuen Basen-Editoren, kurz BEs, machen das möglich.
Basen-Editoren sind Komplexe aus mehreren, über kurze Peptid-Linker miteinander verbundenen Enzymen und einer RNA. Der Prototyp BE1 enthielt ein mutiertes dCas9-Protein, dem man die Neigung zum Zerschnippeln des DNA-Doppelstrangs ausgetrieben hatte. Weiterhin gehörte zu BE1 eine APOBEC1-Cytidin-Deaminase. Als mRNA-spezifisches Enzym, das im wahren Leben die mRNA von Apolipoprotein B editiert, ist es auf Einzelstrang-DNA als Substrat spezialisiert.
Am Zielort, der von der Guide-RNA definiert wird, bindet dCas9 an eine benachbarte PAM-Sequenz. Dann löst sie den DNA-Doppelstrang lokal auf und formiert den sogenannten R-Loop, in dem die Guide-RNA und der dazu komplementäre DNA-Strang ein kurzes DNA-RNA-Hybrid bilden. Den jetzt ungepaarten, nicht-komplementären Strang schnappt sich die Deaminase, um ihr Werk an den dort lokalisierten Cytidinen zu vollbringen.
Das sogenannte Aktivitätsfenster dieses Enzyms ist etwa fünf Basenpaare lang und liegt 13 bis 17 Basenpaare upstream der PAM-Sequenz. In vitro editierte dieses BE1-Konstrukt seine Ziele mit Raten von 25 bis 40 Prozent, in humanen Zellen konnten die Forscher aber fast keine Editierung finden. Das lag an den effektiven zellulären Reparaturmechanismen, die die Fehlpaarung Uracil-Guanin erkannten und wieder in den Ausgangszustand brachten.
Also fusionierten Lius Leute BE1 mit dem Uracil-Glycosylase-Inhibitor (UGI) aus dem Bakteriophagen PBS und erhielten hierdurch BE2. UGI inhibiert das Reparatursystem, sodass aus dem C-G-Basenpaar ein T-A-Paar werden kann. Das war schon mal ziemlich clever.
Diesen letzten Schritt gestaltete die Gruppe aber noch effizienter: Damit das Guanin am nicht-editierten Strang sofort durch ein Adenin ersetzt wird, entwickelte Lius Team die BE3-Variante mit einer dCas9-Mutante, die auf diesem Strang eine Einkerbung (Nick) verursacht. Die Kerbe veranlasst andere DNA-Reparatursysteme, die Stelle mit einem passenden Nukleotid zu flicken – nach dem Editieren geschieht dies mit einem Adenin-Nukleotid.
Soweit der Entwicklungsstand Ende 2016. Dann ging es Schlag auf Schlag: Im Februar 2017 beschrieben die Forscher die biotechnische Veränderung der Deaminase: Sie hatten ihr Aktivitätsfenster auf zwei Basenpaare eingedampft und damit die Wahrscheinlichkeit reduziert, dass das Enzym Off-Target-Mutationen induziert – also auch benachbarte Cytosine deaminiert (Nat. Biotech 35: 371-76).
Aber selbst dieses Konstrukt produzierte nach Lius Geschmack anscheinend noch zu viele unerwünschte (Off-Target) C-zu-U-Verwandlungen. Also zurück ins Labor und weiter gebastelt. Das Ergebnis war der High-Fidelity Base Editor 3 (HF-BE3) mit zwei Kopien des UGI (Nat. Comm 8: 15790).
Es folgten verschiedene BE4-Gam-Kombinationen. Gam ist ein Enzym aus dem Bakteriophagen Mu, das freie Enden von Doppelstrangbrüchen bindet und schützt. Liu und Kollegen hatten festgestellt, dass nukleäre Reparatursysteme doch ab und an hinter dem neuen Uracil die DNA spalten und dadurch Indels produzieren. Mit BE4-Gam-Konstrukten erreichten die Wissenschaftler die gleichen Editier-Frequenzen wie mit BE3-Versionen, konnten die Indels aber auf unter 1,5 Prozent der Ereignisse senken (Sci. Adv. 3: eeao4774).
Wie CRISPR-Cas9 funktionieren auch die Basen-Editoren in allen bisher getesteten Organismen. Ein limitierender Faktor ist die PAM-Sequenz, die direkt neben der Zielsequenz liegen muss. Das am häufigsten zum Editieren verwendete Enzym ist Cas9 aus Streptococcus pyogenes. Dessen PAM-Sequenz lautet NGG. Das ist zwar keine seltene Kombination in den Genomen von Tieren und Pflanzen. Aber nicht immer liegt sie neben einer Zielsequenz.
Weil man weniger restriktive Sequenzen noch nicht gefunden hatte, evolvierten die Forscher um Liu so lange herum, bis sie Cas-Varianten identifizierten, die auch Sequenzen wie NG, GAA oder GAT akzeptierten (Nature 556: 57-63). Außerdem verpassten sie den Editoren Signale, die ihnen helfen, in den Zellkern zu gelangen (nuclear localization signals), optimierten die Codons (alle Komponenten stammen ja ursprünglich aus Prokaryoten, sollen aber in eukaroytischen Zellen arbeiten) und verbesserten auch noch die Deaminase. Diesen Super-Editor nannten sie BE4max (Nat. Biotech. 36, 843-46). Was kann danach noch kommen? BE5supermax?
Mehr oder weniger zeitgleich machte sich das Liu-Team auch daran, einen Adenin-Editor (ABE) zu kreieren, der Adenin in Inosin verwandelt, was zu einer A/T-zu-G/C-Konversion führt. Als Deaminase nutzten sie diesmal eine tRNA-Adenosin-Deaminase aus E. coli. Nach viel Protein-Engineering wandelte die siebte Generation von ABEs die Zielbasen mit einer Effizienz von 50 Prozent um. Die Indel-Rate lag unter 1 Promille – super! (Nature 551: 464-71).
Kaum waren die ersten Basen-Editoren bekannt geworden, machten sich auch schon andere Teams daran, sie an Pflanzen und Tieren auszuprobieren. Egal ob in Weizen, Reis, Tomate, Mais, Mäusen oder humanen Zellkulturen: Immer fand man Reparaturen, wenn auch mit unterschiedlichen Effizienzen und Nebeneffekten.
Die neueste Studie geht einen ersten Schritt in Richtung Gentherapie. BEs sind hierfür besonders interessant, denn erstens sind etwa zwei Drittel der genetischen Varianten, die eine Erkrankung auslösen, Punktmutationen. Und zweitens funktionieren BEs auch in Zellen, die sich nicht oder nur sehr wenig teilen – im Gegensatz zum klassischen CRISPR-Cas.
Eine Gruppe um Gerald Schwank vom Institute for Molecular Health Sciences der ETH Zürich versuchte in einem Proof-of-PrincipleExperiment, mit BEs die Phenylketonurie in Mäusen zu kurieren (Nat. Med. 24: 1519-25). Diese autosomal-rezessiv vererbte Krankheit ist das Resultat von Punktmutationen in dem Gen PAH, das für das Leberenzym Phenylalaninhydroxylase kodiert. Einen erfolgreichen Heilungsversuch erlebten einige bereits erwachsene Mäuse. Der C-zu-T-Basen-Editor reparierte ein defektes Codon im Genom der Leberzellen. Dorthin gelangte er mithilfe von AAV-Vektoren. Dies sind Viren, die bereits seit langem in der Gentherapie verwendet werden. Sie zeigen wenig Nebenwirkungen, ihre Cargo-Kapazitäten sind aber leider beschränkt. „Die BEs sind relativ groß, so dass sie nicht auf einen Adeno-assoziierten Virus passen. Deshalb mussten wir den BE in zwei Teile splitten“, berichtet Erstautor Lukas Villiger. Und Seniorautor Gerald Schwank fügt hinzu: „Dieses Problem zu lösen, war in diesem Experiment die größte Herausforderung.“
Die Forscher verpackten die zwei BE-Teile in jeweils einen Virus und transfizierten beide Viren gleichzeitig. Das funktionierte ganz gut: Die Mäuse verloren die typische, von der Mutation ausgelöste helle Fellfarbe. Die neuen Enzyme waren aktiv und konnten den Gehalt an Phenylalanin innerhalb von sechs Wochen nach der Vireninjektion auf physiologisch normale Werte senken. Der Editor war anscheinend permanent aktiv – die Reparatur-Quote sowohl von genomischer DNA wie auch von mRNA stieg während der 26 Wochen Beobachtungsdauer beständig. Allerdings erhöhte sich auch der Anteil an Indels. Das liegt vielleicht daran, dass die Forscher um Schwank einen BE3-Editor verwendet hatten. Weiter optimierte Editoren könnten in einem solchen Experiment eine niedrigere Indel-Frequenz zeigen.
Mit den bisherigen Resultaten und BEs ist der Werkzeugkasten für das Editieren noch nicht ausgereizt. Die bisher entwickelten ABE und CBE sind nur zwei von sechs Editoren, die man benötigt, um die Basen beliebig ineinander umwandeln zu können.
ABE und CBE bewerkstelligen den Übergang von C zu T, A zu G, T zu C sowie G zu A (Transitions-Mutationen). Das Problem sind Enzyme, die auch die weiteren Austauschmöglichkeiten (Transversions-Mutationen) etwa G zu C oder T zu A katalysieren – diese Enzyme kennt man bisher nicht. Eine Möglichkeit wäre, genauer in Pflanzen zu suchen. Manche Arten können Uracil-Nukleoside in den mRNAs von Mitochondrien und Plastiden zu Cytosinen editieren – genug Potenzial also für weitere Nature-Paper zum Thema Basen-Editing.