(07.02.2022) HALLE/SAALE: Sekundäre Pflanzenstoffe sind medizinisch und kommerziell bedeutsam, doch ihre Gewinnung ist oft unprofitabel. Ein Forschungsteam verlagert daher ganze Synthesewege in besser geeignete Wirtsorganismen – mit Erfolg.
Ob lila Paprikas, gelbe Zucchini oder auch rote Gurken: Ausgefallene Gemüsesorten gibt es zuhauf, auch im Supermarkt stößt man mitunter auf die bunten Abweichler. Entstanden sind diese meist auf natürlichem Weg durch zufällige Mutationen, einige wenige entspringen der gezielten Züchtung. Geschmacklich besteht meist kein großer Unterschied zum tristen Original, es geht oft eher um den optischen Wow-Effekt.
Betrachtet man die Tomaten, die ein Team vom Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie (IPB) in Halle/Saale hergestellt hat, ist der Wow-Effekt ebenfalls nicht von der Hand zu weisen (Front. Plant Sci.12: 682443). Anders als herkömmliche Tomaten haben die Früchte eine dunkelrote, fast schwarze Schale und ein leuchtend rotviolettes Fruchtfleisch. Doch die Neuzüchtung ist weit mehr als eine Farbenspielerei: Sie ist das Ergebnis intensiver Forschung in der Pflanzenbiotechnologie und besitzt viel Potenzial – sowohl in kommerzieller als auch in medizinischer Hinsicht.
Fotos (2): Marillonnet
Ihr Schöpfer ist Sylvestre Marillonnet, der seit 2012 die Arbeitsgruppe für synthetische Biologie am IPB leitet. Der gebürtige Franzose etabliert und optimiert Klonierungsmethoden, die das Einfügen multipler Transgene in Wirtszellen erleichtern sollen. Schon beim Biotech-Unternehmen Icon Genetics ein paar Straßen weiter, wo er zuvor 13 Jahre tätig war, hatte er erfolgreich an Verfahren getüftelt, um beispielsweise Tabakpflanzen gentechnisch zu verändern. Marillonnet erläutert: „Bei Icon Genetics habe ich gemeinsam mit Kollegen 2008 die sogenannte Golden-Gate-Klonierung etabliert, die inzwischen zum Standardrepertoire vieler Molekularbiologen weltweit gehört. Meine Forschung hier am IPB basiert auf diesem Verfahren, das wir weiterentwickeln und praktisch nutzbar machen wollen.“
Bei der Golden-Gate-Klonierung kommen spezielle Restriktionsenzyme vom Typ IIS zum Einsatz. Anders als herkömmliche Restriktionsenzyme schneiden diese den DNA-Strang außerhalb ihrer Erkennungssequenz, wodurch an jeder Schnittstelle ein anderer Überhang entsteht. Molekularbiologen können so mehrere Fragmente in einer ganz bestimmten Reihenfolge – je nach Überhang – aneinanderreihen. Ein weiterer Vorteil: Platziert man die Erkennungssequenz richtig, schneiden Typ-IIS-Enzyme diese gleich mit heraus. Die Enzyme erkennen so nur noch ungeschnittene, aber nicht mehr bereits assemblierte Fragmente. Das Verfahren wird viel effizienter. Mit der Golden-Gate-Methode assemblieren Molekularbiologen heute mühelos dutzende von DNA-Fragmenten in einem einzigen Reaktionsmix.
Auch das Hallenser Forschungsteam konnte so ein ganzes Arsenal an komplexen Expressionskassetten herstellen. Jede Kassette enthält mehrere Gensequenzen mit allem nötigen „Zubehör“ – Promotoren, Terminatoren und anderen regulatorischen Elementen. Die Gene selbst codieren für Enzyme aus dem Betalain-Syntheseweg der Roten Bete (Beta vulgaris). Marillonnet erklärt, was es damit auf sich hat: „Das Ziel unserer Studie war es, den kompletten Syntheseweg eines sekundären Pflanzenstoffs nachzubauen und dann in eine Wirtspflanze einzuschleusen. Betalaine sind eine Gruppe sekundärer Pflanzenstoffe, die vor allem in Roter Bete vorkommen. Ihre Farbe ist sehr kräftig, deshalb eignen sie sich hervorragend zum Testen unseres Expressionssystems.“
Dass die Gruppe einen sekundären Pflanzenstoff für ihre Studie ausgewählt hat, ist kein Zufall. Viele Sekundärmetaboliten aus dem Pflanzenreich sind kommerziell attraktiv. Sie bilden die Basis für Nahrungsergänzungsmittel, Lebensmittelfarben und Arzneistoffe. Viele Pflanzen produzieren jedoch nur kleine Mengen oder sind schwer zu kultivieren, was die Gewinnung unprofitabel macht. Die Lösung: Man verlagert die ganze Synthese in eine Nutzpflanze, die besser wächst und obendrein auch mehr der kostbaren Sekundärmetaboliten produziert.
Leichter gesagt als getan. Im Labor testeten Marillonnet und Co. zunächst, ob die Enzyme aus dem Syntheseweg überhaupt ausreichen, um Betalain zu produzieren. Ähnliche Studien mit Tomaten scheiterten nämlich an einer zu geringen Syntheserate. Um das zu vermeiden, exprimierte Marillonnets Team neben den drei Hauptenzymen auch das Enzym α-Arogenatdehydrogenase (ADHα). Die ADHα selbst ist nicht an der Betalain-Synthese beteiligt, sondern synthetisiert die Aminosäure Tyrosin, den Ausgangsstoff für die eigentliche Betalain-Herstellung. Das zusätzliche Enzym verfehlte seine Wirkung nicht: Als die Gruppe Blätter der Tabakpflanze Nicotiana benthamiana mit den vier einzelnen Konstrukten infiltrierte, sahen sie wie erhofft eine starke rote Färbung im gewonnenen Extrakt. Ohne ADHα war die Farbstoffmenge beinahe fünfzig Prozent geringer.
Dann wurde es spannend: Wie viel Betalain konnten die Tabakpflanzen herstellen, wenn die vier Genkassetten auf ein und demselben Plasmid waren statt auf vier einzelnen? „Die Menge an Farbstoff war ähnlich wie im Vorversuch“, zeigt sich der Molekularbiologe rückblickend erleichtert. „Am besten funktionierte es, wenn wir neben den vier Genkassetten noch einen TAL-Effektor mit in die Pflanze eingebracht hatten.“
TAL-Effektoren (TALE) sind bakterielle Transkriptionsfaktoren mit einer besonderen Eigenschaft: Sie benötigen lediglich ein Motiv aus 18 Nukleotiden, um zuverlässig zu binden. Wie stark die Bindung letztlich ist, hängt maßgeblich von den Basen um dieses Motiv herum ab. Das hat gleich mehrere Vorteile: Es gibt fertige Datenbanken mit dutzenden TALE-Motiven, die alle möglichen Bindungsstärken abdecken. Das Team kann also für jedes Enzym des Synthesewegs die Expression einzeln justieren und benötigt nur einen gewebespezifischen Promotor für das TALE-Gen. Ohne TALE bräuchten Marillonnet et al. hingegen vier verschiedene Promotoren, die alle im selben Gewebe zur gleichen Zeit aktiv sein müssen – in vielen Fällen schwer bis gar nicht zu finden. Nimmt man stattdessen den gleichen Promotor mehrmals, werden die Plasmide häufig instabil und tendieren zu ungewollten Rekombinationen.
Mit dem etablierten TALE-System verließ das Team die Tabakblätter und machte sich daran, die Betalain-Synthese in Tomaten anzuwerfen. Dafür packten sie das Plasmid mit den vier Enzymen plus TALE-Gensequenz in einen Agrobacterium-Stamm und inkubierten die Keimblätter junger Pflanzen der Sorte „MicroTom“ mit den transformierten Bakterien. Dank eines gewebespezifischen Promotors vor dem TALE-Gen sollte die Betalain-Synthese nur in den Früchten der Pflanze erfolgen. Zum Leidwesen der Forscher waren die Tomaten allerdings genauso hellrot wie die Früchte der Kontrollpflanzen. Offenbar funktionierte, anders als in den vorigen Versuchen, das TALE-System hier nicht richtig. Wie so oft in der Wissenschaft musste ein Plan B her.
Der war glücklicherweise nicht nur schnell gefunden, sondern auch erfolgreich. Marillonnet: „Als wir sahen, dass wir keine TALE-Tomaten herstellen konnten, haben wir das System umgebaut. Wir stellten jedem der vier Enzyme den gleichen fruchtspezifischen E8-Promotor voran, dafür ist das TALE-Gen komplett rausgeflogen. Unsere Befürchtungen, die Genkassette würde dadurch zu instabil, haben sich zum Glück nicht bestätigt.“ Auch die jetzt identischen Expressionslevel aller Enzyme waren offenbar kein Problem: Im Gegenteil, die Tomaten produzierten große Mengen an Betalain – sogar mehr als das Vorbild, die Rote Bete selbst.
Wie robust die Synthese ablief, demonstrierte das Forschungsteam anschließend, indem es die „MicroTom“-Pflanzen mit zwei kommerziell bedeutsameren Sorten, „Moneymaker“ und „M82“, kreuzte. Beide Sorten hatten auch nach mehreren Generationen ähnliche Betalain-Level in all ihren Früchten. Interessant dabei: Das Team schaffte es nicht, „Moneymaker“ und „M82“ direkt zu transformieren. Marillonnet hat eine Vermutung, woran das liegt: „Wir schaffen es zwar ‚MicroTom’ mit der intakten Genkassette zu transformieren. Allerdings sehen wir auch hier einige Pflanzen, in denen Teile der Genkassette deletiert sind. Das heißt, unser Plasmid mit den vier E8-Promotoren ist in der Tat instabil, aber wir bekommen trotzdem genügend positive Klone. Einmal im Pflanzengenom integriert, ist das Konstrukt dann auch stabil. Bei ‚Moneymaker’ und ‚M82’ brauchen wir aber anscheinend mehr intakte Genkassetten, um überhaupt positive Pflanzen zu erhalten – warum auch immer.“
Doch wie erhöht man die Stabilität der Genkassette im Vektor? Marillonnets Lösung sind Plasmide, die sich langsamer vermehren. Solche Low-Copy-Plasmide werden von Bakterien weniger oft repliziert. Das beugt ungewollten Rekombinationen der DNA vor, denn die treten vor allem während der Replikation auf. Marillonnet und Co. haben geeignete Low-Copy-Plasmide hergestellt, ihre Sequenzen sind beim Webportal „Addgene“ frei zugänglich.
Wie fällt das Fazit des Forschers aus? Ist Marillonnet zufrieden, trotz der Probleme mit dem TALE? „Wir waren definitiv erfolgreich. Es ist uns nicht nur gelungen, erstmalig eine Genkassette zu transformieren und zu exprimieren, die viermal den gleichen Promotor enthält. Wir konnten auch die Synthese von Betalain in Tomaten mit ADHα entscheidend verbessern und so einen Sekundärmetaboliten in großen Mengen zuverlässig herstellen. Das ist toll und ein wichtiger Fortschritt, der sich hoffentlich auf viele andere Sekundärmetaboliten übertragen lässt.“
Und was wird aus den Tomaten? Im Supermarkt werden die Neukreationen wohl nicht landen. Als Färbemittel haben sie jedoch Potenzial. Die transgenen Tomaten produzieren nämlich, anders als Rote Bete, fast ausschließlich ein bestimmtes Betalain, das rotviolette Betanin. Ihr Saft färbt Lebensmittel dadurch mit einem kräftigen Farbakzent, der an das leuchtende Rotviolett von Fuchsien erinnert. Als Antioxidans wirkt Betanin zudem positiv auf die Gesundheit. Also beste Voraussetzungen für einen kommerziellen Durchbruch? Der Molekularbiologe lächelt nur und gibt zu bedenken: „Die große Frage ist, ob die Verbraucher Saft von gentechnisch veränderten Tomaten akzeptieren würden. Gerade in Europa dürften Unternehmen deshalb eher zurückhaltend sein.“
Die Zukunft wird zeigen, ob die Zweifel berechtigt sind. Es wäre schade um die schönen Früchte.