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Knackpunkt Fusion

Tobias Ludwig


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Mithilfe von Glyko-Oberflächenproteinen gelangen Herpesviren in menschliche Zellen – aber wie genau? Illustr.: Adobe Stock/auntspray

(08.04.2021) HAMBURG: Hoch im Norden versuchen Strukturbiologen zu ergründen, wie das Herpesvirus in menschliche Zellen eindringt und wie man widerspenstige Proteine bändigt.

Bevor sich Viren vermehren können, müssen sie zuerst in eine geeignete Wirtszelle schlüpfen. Einige Viren, darunter Herpes simplex, bewerkstelligen das, indem sie mit der Membran menschlicher Zellen fusionieren. Wie dieser Prozess genau funktioniert, fragen sich Virologen weltweit – auch Kay Grünewald vom Heinrich-Pette-Institut, Leibniz-Institut für Virologie und der Universität Hamburg. Die Gruppe um Grünewald konnte das Rätsel nun weiter lösen; ihre Ergebnisse haben sie vergangenes Jahr in Science Advances veröffentlicht (6: eabc1726).

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Eine komplexe Sache

Zunächst waren Herpesviren für Grünewald jedoch nur Mittel zum Zweck: „Ich wollte nach meiner Promotion innovative strukturbiologische Methoden lernen und entdeckte die Kryo-Elektronentomographie für mich, die damals noch in den Kinderschuhen steckte. Und dafür brauchte ich noch ein passendes Studienobjekt“. Seine Wahl fiel auf Herpesviren, die durch ihre Vielgestaltigkeit interessante Modellorganismen darstellen. Die Viren zogen Grünewald jedoch so sehr in den Bann, dass er bei ihnen blieb. Ähnlich erging es auch Erstautor Benjamin Vollmer, der als Doktorand über Kernporenkomplexe den Weg zu viralen Fusionsprozessen fand.

Doch wie kommt das Virus in die Zelle? Vollmer: „In der Regel driftet das Virus zufällig an einer Zelle vorbei. Dabei kommt es zuerst zu unspezifischen Interaktionen, die dazu führen, dass das Virus an der Zelle haften bleibt.“ Die Fusion werde eingeleitet, wenn Glykoproteine, die auf der Oberfläche des Virus sitzen, an bestimmte Zellrezeptoren binden, beispielsweise Nektin 1 oder den Herpesvirus Entry Mediator HVEM. Die eigentliche Penetration der Zellmembran leiste dann das Glykoprotein B zusammen mit den Glykoproteinen H und L. Dabei aktivieren H und L das Glykoprotein B und sorgen dafür, dass dieses sich umfaltet. So können die hydrophoben Fusionsschleifen in die Wirtsmembran eindringen und das Virus direkt mit der Oberfläche verankern. Eine weitere Konformationsänderung führe dazu, dass Wirts- und Virusmembran zusammengezogen werden. Eine Fusionspore entsteht, durch die das virale Capsid, welches das Genom enthält, in die Wirtszelle eindringen kann. „Dieser Prozess ist bei Herpes simplex sehr komplex und wir verstehen noch nicht völlig, was die eigentliche Fusion triggert“, erklärt Strukturbiologe Vollmer. Bei anderen Vertretern, wie dem Influenza- und Vesikulären Stomatitis-Virus, erledige diese Aufgabe ein einziges Protein, das allein durch einen niedrigen pH-Wert in Fusionsbereitschaft versetzt werden könne.

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Hat sich das Glykoprotein für die Fusion umgefaltet, ist diese sogenannte Postfusionsform energetisch stabil. „Lange kannte man nur die gestreckte Struktur des Proteins. Versucht man das Molekül aufzureinigen, geht es stets in diese Form über, da konventionelle Methoden immer die stabilisierende Membran entfernen, in der das Protein sitzt“, schildert Grünewald. Das Problem: Auf dem Virus liege das Glykoprotein natürlich vorwiegend in der metastabilen Präfusionsform vor. Dies sei auch die Struktur, gegen die effektiv Antikörper gebildet werden können. Auf der Suche nach der Präfusionsform entwickelten die Hamburger eine Methode, mit der sich das Glykoprotein B in der natürlichen Membran aufreinigen lässt (Structure 22: 1687-92).

Mangelnde Auflösung

Wird das Protein in Zellen überexprimiert, bilden diese extrazelluläre Vesikel, die das Glykoprotein fast als alleiniges Transmembranprotein enthalten. Dabei fiel den Forschenden auf, dass das Protein in zwei unterschiedlichen Formen vorkommt. „Auf den Vesikeln haben wir erstmals neben der bekannten Postfusionsform auch die metastabile Präfusionsform entdeckt“, erinnert sich Vollmer. Dabei sei das Verhältnis von Prä- zu Postfusionsform etwa 70 zu 30 gewesen. In einer früheren Arbeit gelang es der Gruppe so, eine erste Struktur der Präfusionsform zu erstellen (PNAS 113: 4176-81). Doch die geringe Auflösung ließ viele Fragen offen. „Das Protein scheint in der Präfusionsform eine gewisse Flexibilität zu haben. Das zusammen mit der gemischten Population aus Prä- und Postfusionsform auf den Vesikeln machten die Strukturanalyse extrem schwierig.“

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Mutiertes Scharnier

Für eine genaue Strukturaufklärung galt es also, die Präfusionsform zu stabilisieren. Dazu nutzten die Hamburger Computersimulationen (Molekulardynamik-Simulationen) und vergleichende Sequenzanalysen mit den bereits vorhandenen Kristallstrukturen des verwandten Glykoproteins des Vesikulären Stomatitis-Virus. Grünewald: „Wenn man die Glykoprotein-B-Sequenz und Postfusionsstruktur mit verwandten Proteinen vergleicht, sieht man, dass eine zentrale, helikale Domäne besonders gut konservierte Bereiche aufweist.“ Mit Simulationen dieser Domäne konnte das Forscherteam vorhersagen, wo der flexible Teil in der Helix lag, der die Konformationsänderung ermöglichte. Sie identifizierten drei Aminosäurereste in der zentralen, helikalen Domäne, die als Scharnier zu fungieren scheinen. Dort setzten die Strukturbiologen sukzessive Punktmutationen und untersuchten die resultierenden Protein-Mutanten. „Es gelang uns, eine Mutante zu identifizieren, bei der weder die Expression noch die posttranslationale Modifikation beeinträchtigt waren“, erzählt Vollmer.

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Kay Grünewald (li.) und Benjamin Vollmer versuchen, störrische Oberflächenproteine von Herpesviren zu bändigen – mit Erfolg. Fotos: DESY/Marta Mayer (li.) und Privat

Die mit dieser Mutante beladenen Vesikel untersuchte die Gruppe um Grünewald mittels Kryo-Elektronentomographie. Dazu froren die Hamburger die Vesikel auf einem Gitternetz in einem etwa 200 bis 400 Nanometer dünnen, glasartigen Eisfilm ein. Die Strukturbiologen lichteten die Vesikel mithilfe eines Kryo-Elektronenmikroskops aus unterschiedlichen Winkeln ab und fügten die Einzelbilder zu einer hochauflösenden, dreidimensionalen Abbildung zusammen. In dem resultierenden 3D-Bild, dem Tomogramm, suchten sie nun nach dem Glykoprotein B. Dieses kam durch die von den Hamburgern eingeführte Mutation fast nur in der Präfusionsform vor. Nun galt es, jedes einzelne Protein in den errechneten 3D-Bildern für die Strukturauflösung auszumachen. Eine Sisyphos-Aufgabe, wie Vollmer erklärt: „Wir haben in den verschiedenen Tomogrammen die einzelnen Glykoproteine identifiziert, ausgeschnitten und dann mehr als 46.000 dieser 3D-Bildschnipsel übereinandergelegt, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren.“ Insgesamt gingen für das Projekt etwa drei Jahre ins Land, erinnert sich Grünewald.

Der Lohn für die Mühen: eine bisher nie dagewesene Auflösung der 3D-Struktur des Glykoproteins B von neun Angström. Zudem widerlegten die Hamburger ihre bereits 2016 in PNAS postulierte Lokalisation der Domäne 1. „Damals hat die Auflösung nicht gereicht, um die Position der Domäne genau bestimmen zu können, obwohl wir die Struktur verschiedenfach validiert hatten. Diesmal haben wir auch deswegen so lange daran gearbeitet, um wirklich sicher zu sein“, erklärt Grünewald. Zudem sei das Protein zuvor aufgrund der fehlenden Fixierung flexibler und dadurch unschärfer gewesen. Durch die verbesserte Auflösung seien sich die Strukturbiologen nun jedoch sicher.

Ein paar Fragen für die Zukunft bleiben jedoch offen. Vollmer: „Wir konnten das Protein durch die Mutation zwar in der Membran gut stabilisieren, sobald wir es jedoch dort herauslösen, flippt es in die Postfusionsform.“ So sei das nächste Ziel, die Präfusionsform weiter zu stabilisieren, auch um letzte strukturelle Unklarheiten beispielsweise durch Röntgenkristallografie zu beseitigen. Zudem scheint das Glykoprotein B nicht nur bei der Membranfusion, sondern auch bei der Assemblierung der Viruspartikel eine Rolle zu spielen.

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