Info

Arabidopsis mit Jetlag

Sigrid März


Info

Info

Neuer Mehrfachdispenser von BRAND: Das moderne Touch-Bedienkonzept macht die Arbeit einfach und effizient. mehr

BIELEFELD: Zellphysiologen nehmen die innere Uhr der Ackerschmalwand unter die Lupe und zeigen, dass die Hilfsuhr AtGRP7 etliche Prozesse auf Transkriptebene reguliert.

jc_18_01_03a
In Arabidopsis leitet eine Hilfsuhr Zeitinformationen der inneren Uhr an Transkripte weiter. Foto: Uni Bielefeld

2017 war das Jahr der Chronobiologie: Im vergangenen Dezember nahmen die US-Amerikaner Jeffrey Hall, Michael Rosbash und Michael Young in Stockholm den Nobelpreis für Medizin/Physiologie für ihre Forschung zur inneren Uhr entgegen. Dieses universelle und hochkonservierte Phänomen steuert mannigfaltige Prozesse im lebenden Organismus und passt Einzeller sowie Menschen an den 24-Stunden- oder zirkadianen Rhythmus des irdischen Lebens an.

Info

Info

Bestellen Sie noch heute Ihr kostenfreies Exemplar. mehr

Erstmals erwähnt wird die innere Uhr bereits Anfang des 18. Jahrhunderts, systematisch erforscht seit den 1970er-Jahren (siehe auch das LJ-online-Editorial vom 02.10.17). In der Taufliege (Drosophila melanogaster) fanden Forscher ein Genprodukt, das im 24-Stunden-Rhythmus periodisch auftauchte und verschwand. Diesem kurzerhand period getauften Gen folgten weitere, nicht minder kreativ betitelte ‚Uhren-Gene‘ wie timeless, clock oder cycle, allesamt Bestandteil eines komplexen ‚Zelluhrwerks‘, welches nicht nur sich selbst reguliert (Transcription-Translation Feedback ­Loop), sondern auch weitere Gene rhythmisch an- und abschaltet. Die Folge sind Genprodukte, deren Mengen im Tagesverlauf oszillieren. Offensichtlich ist dies bei der Steuerung des Wach- und Schlaf-Rhythmus‘, vor allem, wenn ein Mensch sich zwischen den Zeitzonen bewegt (Jetlag). Aber auch die Produktion von Verdauungsenzymen oder Hormonen unterliegt der 24-Stunden-Rhythmik.

Innere Uhr von Pflanzen

Dass auch Pflanzen sich dem Diktat ihrer inneren Uhr unterwerfen, weiß Dorothee Staiger, seit 2002 Lehrstuhlinhaberin und Leiterin der Abteilung für RNA-Biologie und Molekulare Physiologie an der Universität Bielefeld. Bereits seit ihrer Zeit als Oberassistentin an der Eidgenössischen Technischen Hochschule (ETH) Zürich ergründet die Biochemikerin die zirkadiane Rhythmik, die es Pflanzen erlaubt, ihren Stoffwechsel an ihre Umgebung anzupassen. „Man hat schon sehr früh beobachtet, dass Pflanzen ihre Blätter bei Tag ausbreiten und nachts absenken. Das machen sie sogar unabhängig vom Hell-Dunkel-Wechsel“, sagt Staiger und fügt hinzu: „Bereits damals gab es die Idee einer inneren Uhr, die solche Prozesse steuert. Tatsächlich fanden Forscher auch in Pflanzenzellen Transkripte, also ­mRNAs, die im Tagesverlauf oszillieren.“

Info

Info

Info

Der Eppendorf Online Shop bietet für jedes Labor das passende Produkt, viele Aktionen inklusive. mehr

Heute ist bekannt, dass etwa dreißig Prozent des Ackerschmalwand-Genoms zirkadian reguliert werden. Das habe durchaus Sinn, so Staiger weiter. Beispielsweise müssen Photosynthese-relevante Genprodukte morgens am stärksten exprimiert werden, denn dann laufen die Chloroplasten zur Hochform auf. Umso erstaunter waren die Bielefelder Forscher, als sie in ihrem Modellorganismus auf AtGRP7 (Arabidopsis thaliana glycine-rich RNA-binding protein 7) stießen, welches ebenfalls im 24-Stunden-Takt oszilliert. Aber: „Wir haben festgestellt, dass dieses Gen am Abend maximal exprimiert wird. Das kannte man damals so nicht“, betont Staiger.

AtGRP7 gehört zu den RNA-bindenden Proteinen (RBP), die RNA-prozessierende Abläufe von der Synthese bis zum Abbau regulieren. Somit ermöglichen sie eine Anpassung der Genexpression auch noch nach dem Start der Transkription. In Arabidopsis sind etwa zweihundert RBPs mit einem RNA recognition motif, einer speziellen RNA-Binde-Domäne, bekannt. Eines davon ist AtGRP7.

Kovalente Vernetzung

Welchen Einfluss aber hat AtGRP7 auf das Transkriptom der Pflanze? Mithilfe der Methode iCLIP (individual nucleotide resolution crosslinking and immunoprecipitation) machten die Ostwestfalen zahlreiche Transkripte dingfest und veröffentlichten die Ergebnisse im vergangenen Oktober in Genome Biology (18: 204). „Wir bestrahlen Pflanzenzellen mit UV-Licht, was zu einer kovalenten Vernetzung von RNA und Protein führt, wenn diese in direktem Kontakt stehen“, erläutert Katja Meyer das iCLIP-Grundprinzip.

Die Biologin hat in der Arbeitsgruppe von Staiger promoviert und ist gemeinsam mit ihrem Kollegen Tino Köster Erstautorin der Studie. Biologe Köster, der ebenfalls in Bielefeld promoviert hat und seit 2014 dort als Postdoc arbeitet, erklärt, dass anfangs nicht klar gewesen sei, ob die in Zellkulturen routinemäßig angewandte Methode im komplexeren Pflanzenmodell überhaupt funktionieren würde: „In lebenden Pflanzen muss das UV-Licht durch verschiedene Zelltypschichten dringen“, gibt er zu bedenken. „Die photosynthetisch aktiven Organismen haben zudem eine Vielzahl von Schutzpigmenten, die sie vor allzu starker Bestrahlung schützen.“ Meyer und Köster zeigten, dass die gewählten Parameter die UV-Stress-Maschinerie in Arabidopsis nicht aktivieren, eine wichtige Voraussetzung für die Durchführung der Experimente.

Vernetzte AtGRP7-RNA-Komplexe werden über eine Immunpräzipitation aus lysierten Pflanzenzellen isoliert. „Bevor wir die gebundenen RNAs isolieren, verdauen wir das Protein enzymatisch“, beschreibt Meyer das weitere Vorgehen. „Ein Rest des Proteins bleibt aber an der RNA zurück. Wenn wir jetzt RNA in DNA umschreiben, bricht die Reverse Transkriptase an diesem Proteinrest ab.“

Damit offenbart sich der große Vorteil von iCLIP: Eine anschließende Hochdurchsatzsequenzierung der DNA-Stücke zeigt nicht nur, welche Transkripte AtGRP7 ursprünglich gebunden hatte, sondern auch, an exakt welcher Stelle diese Interaktion stattfand. Für die 858 potentiellen AtGRP7-Zieltranskripte ergab sich somit eine globale Bindemotiv-Karte. So zeigte sich, dass AtGRP7 nicht nur in Exons bindet, sondern auch in untranslatierten Transkriptregionen – ein Hinweis, dass dieses RNA-Bindeprotein zur posttranskriptionalen Kontrolle fähig ist.

Um den Kreis der Transkripte einzuengen, wendeten Meyer, Köster und Co. eine weitere Methode an: RIP-seq (RNA immunoprecipitation sequencing). Hier vernetzt Formaldehyd nicht nur Protein mit RNA, sondern auch Protein mit Protein, und erlaubt so einen umfassenderen Blick auf zelluläre Komplexbildung.

Zuverlässige Bindeproteine

Nun galt es, die Datensätze von iCLIP und RIP-seq abzugleichen. „Alle Hochdurchsatzmethoden sind anfällig für Hintergrundrauschen. Gerade die Bestimmung der Bindeorte des RNA-Bindeproteins mittels iCLIP ist nicht trivial“, so Köster. „Die bioinformatische Auswertung der Daten, die wir mittels Sequenzierung generiert haben, haben wir in Kooperation mit Ivo Grosse von der Martin-Luther-Universität in Halle gemacht.“ Die Schnittmenge der beiden unabhängigen Methoden führte zu 452 Transkripten, welche die Autoren ‚High-confidence binders‘ von AtGRP7 nennen.

jc_18_01_03b
Die Chronobiologin Dorothee Staiger (m.) untersucht mit ihren Postdocs Katja Meyer und Tino Köster die Rolle der „Hilfsuhr“ AtGRP7 beim zirkadianen Rhythmus von Arabidopsis. Foto: Sigrid März

Ein Vergleich mit einer Liste bekannter zirkadian regulierter Arabidopsis-Transkripte zeigte, dass immerhin knapp fünfzig Prozent dieser RNAs Bestandteil des inneren Pflanzenuhrwerks sind; unter ihnen DRM2 (Dormancy/Auxin associated family protein) oder AILP1 (Arabidopsis thaliana aluminium-induced-like protein 1). Aber auch andere Transkripte tauchten auf, wie zum Beispiel ATHSPRO2 (ortholog of sugar beet hs1 pro-1 2), welches Arabidopsis bei der Resistenz gegen Pseudomonas syringae unter die Arme greift.

Jetzt hatten die Forscher zwar eine umfangreiche Liste an potentiellen AtGRP7-Transkripten, wussten aber bisher nicht, ob diese Bindungen für die Pflanze tatsächlich relevant sind. Deshalb erstellten sie mittels RNA-seq, also der Sequenzierung der gesamten in cDNA umgeschriebenen mRNA eines Organismus, Transkriptome von Arabidopsis-Pflanzen, die AtGRP7 entweder konstitutiv überexprimierten oder denen AtGRP7 gänzlich fehlte, und verglichen sie mit unveränderten Pflanzen.

„Wenn die Bindung des Proteins an die RNA relevant ist, sollte man in Nullmutante und Überexprimierer beobachten, dass die RNA zum Beispiel abgebaut oder alternativ gespleißt wird“, erklärt Staiger. Und Köster ergänzt: „Erst mit den verschiedenen Datensätzen aus iCLIP, RIP-seq und RNA-seq hatten wir die Möglichkeit, die Ergebnisse funktionell miteinander zu kombinieren und zu korrelieren.“

Die Autoren sahen, dass AtGRP7 einige Zieltranskripte hemmt und andere aktiviert. Eine veränderte Menge an RNA-Bindeprotein sorgt für ‚Rhythmusstörungen‘ bei ihren Ziel-RNAs, Pflanzen-Jetlag quasi. Das für Salztoleranz wichtige FAD2 (fatty acid desaturase 2) beispielsweise ist in AtGRP7-überexprimierenden Arabidopsis herunterreguliert. Solche Pflanzen keimen und wachsen schlechter unter Salzstress.

Was genau macht AtGRP7? „Wir zeigen, dass dieses RNA-Bindeprotein wie eine Art Hilfsuhr Zeitinformationen von der übergeordneten inneren Uhr über direkte Bindung an weitere Transkripte in der Zelle weiterleitet“, so Staiger. Denn die innere Uhr könne unmöglich alle von ihr beeinflussten Gene direkt kontrollieren. Dafür gäbe es Zwischenstufen wie die Hilfsuhr AtGRP7.

Zeitüberträger

Wie dies mechanistisch vonstattengehen könnte, erklärt Köster am Beispiel der Autoregulation von AtGRP7: Bindet AtGRP7 sein eigenes Transkript, entsteht durch alternatives Spleißen ein vorzeitiges Stoppcodon im Leseraster; das fehlerhafte Transkript wird abgebaut: Weniger Transkript, weniger Protein. Bei reduzierter Menge an AtGRP7 hingegen kann wieder mehr RNA abgelesen werden: Die Proteinmenge steigt wieder. „Aber das ist sicherlich nicht der einzige denkbare Mechanismus. Wir wissen, dass AtGRP7 auch Vorläufer von mikroRNAs bindet. Die wiederum regulieren ihrerseits Transkripte“, meint Köster.

Möglicherweise beeinflusst AtGRP7 auch die Stabilität und dadurch die Halbwertszeit eines gebundenen Transkriptes. Denn in den RNA-seq-Experimenten fanden sich auch Transkripte, deren Menge unverändert war. Staiger listet mögliche Gründe hierfür auf: AtGRP7 könne die Translation der RNA beeinflussen, Translokationen der RNA zum Beispiel vom Zellkern ins Zytoplasma initiieren oder die Bindung von mikroRNAs verhindern.

„All diese Regulationen können wir nicht über Transkriptom-Messungen darstellen, denn die Menge an Transkript ändert sich nicht, obwohl AtGRP7 bindet“, so Staiger. „Da haben wir uns jede Menge neue Arbeit gemacht, um herauszufinden, was das Protein tatsächlich mit den Transkripten macht“, fügt die Zellphysiologin hinzu und lacht.



Letzte Änderungen: 10.10.2019
Diese Website benutzt Cookies. Wenn SIe unsere Website benutzen, stimmen SIe damit unserer Nutzung von Cookies zu. Zur ausführlichen Datenschutzinformation