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(07.07.2015) Es gibt ein Leben außerhalb der akademischen Welt und diese Welt ist höchst spannend. Der Weg des Autors zu einer eigenen Gruppe, zu unabhängiger Forschung und Selbstständigkeit war weder geradlinig noch die Konsequenz geplanter Karriereschritte. Dennoch schätzt er heute die aus derartiger „Ziellosigkeit“ entstehenden Möglichkeiten: Die Kontakte mit brillanten Akademikern und Unternehmern – und die Ideen, die einem zufliegen, wenn man sich in den Wind stellt.

Der Weg des ersten Protisten im Urschlamm des noch jungen Planeten hin zu erhabenen Vielzellern – zweibeinig, ausgestattet mit Hirn, den Vorzügen sexueller Fortpflanzung und mobiler Telefonie – war ein durchaus langer. Aus Sicht jener ersten zur Teilung befähigten Bläschen schien es allerdings schlicht aussichtslos, durch bloßen Zufall in diese Zukunft zu stolpern. Rückblickend erscheint uns dieser Weg allerdings geradezu folgerichtig: Hier und da ein kleiner Geniestreich, eine ausgesessene Katastrophe, ein paar hilfreiche Zufälle – und schon bohren wir mit Stöckchen Maden aus dem Holz, bauen Lokomotiven und schmeißen ferngesteuerte Modellautos auf den Mars.

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Ähnlich fern erscheint dem Studenten das illustre Leben des etablierten Professors – ausgestattet mit einem unabhängigen Forschungsbetrieb, internationaler Anerkennung und einem Stapel selbstverfasster Artikel. Nicht ganz zu Unrecht.

Die Europäische Kommission unterstützt den wissenschaftlichen Nachwuchs auf dem Weg zur akademische Spitze mit einer Reihe attraktiver Förderprogramme; ich selber habe das Glück, als Vertreter des „Private Sectors“ an zwei solcher Initiativen teilnehmen zu können. Sogenannte „Marie Curie Initial Training Networks“ fördern die länderübergreifende Mobilität junger Forscher und finanzieren deren Promotion beziehungsweise einen ersten Postdoc-Aufenthalt im Ausland. Dafür bilden mehrere Labors mit einem gemeinsamen wissenschaftlichen Fokus über die Laufzeit von vier Jahren ein Netzwerk und bieten neben der individuellen Betreuung im Labor regelmäßige Treffen der Doktoranden, Workshops und gemeinsame Seminare an den unterschiedlichen Standorten.

Lesern, die sich am Ende ihrer universitären Ausbildung befinden und eine Promotion erwägen, seien die Angebote der EU empfohlen. Die Programme sind – nicht nur finanziell – sehr attraktiv und zukunftsweisend (http://ec.europa.eu/research/mariecurieactions).

Im Rahmen des letzten Seminars trafen sich die „Fellows“ mit ihren „PIs“ am Comer See in pittoresker Umgebung: Hier sollten Maßnahmen fokussierter und erfolgsversprechender Schritte aufgezeigt werden, mittels derer man den studentischen Urschlamm hinter sich lassen und in den wissenschaftlichen Olymp hineinevolvieren kann. Diese Maßnahmen wurden illustriert an den nachweislich erfolgreichen und fraglos beeindruckenden Karrieren der beteiligten Professoren – quasi ein Schaulaufen der Positiv-Kontrollen: Der eine oder andere Geniestreich, publiziert in hochgeachteten Fachzeitschriften, verbunden mit klug gewählten Laboraufenthalten als Doktorand und Postdoc; zur rechten Zeit am rechten Ort – die Katastrophen bleiben Randnotizen der Erfolgsstory, anekdotisch aufbereitet sind sie immerhin geeignet, den menschlichen Faktor in einer geselligen Runde zu illustrieren. Aber auch hier unterscheidet sich eben der stets sorgenvolle Blick nach vorne substantiell vom Rückblick auf eine erfolgreiche Uni-Karriere, denn so viel hat der Student dann auch schon verstanden: Die vortragenden Positiv-Kontrollen sind die wenigen Überlebenden eines einigermaßen erbarmungslosen Selektionsprozesses!

Im Auditorium unter den Studenten hatte nun also auch ich die Gelegenheit, still die eigene Karriere Revue passieren zu lassen. Im Abgleich mit den präsentierten Lebensläufen erscheint meine persönliche Laufbahn deutlich schattiger: Nach dem Studium an einer bayrischen Provinz­uni in einer immerhin bemerkenswert schönen Stadt diplomierte ich über die Differenzierung von Heterozysten in Blaualgen – auch damals nicht im Fokus des internationalen Interesses –, um dann hochmotiviert in einem echten „High Profile Lab“ Hefegenetik zu betreiben und dort (neues Labor, neue Technologien, erhöhter Druck und beschleunigte Taktung) eine epische Bauchlandung hinzulegen.

Der zweite Versuch zu promovieren war dann erfolgreicher, allerdings erneut nicht der Grundstein eines späten akademischen Senkrechtstarts. Vielmehr verschlug es mich in ein damals junges Biotech-Unternehmen und ich war begeistert, welche Dynamik Wissenschaft entfalten kann, wenn ein integrierter Wissenschaftsbetrieb sich aus verschiedenen Richtungen einer zentralen Frage nähert. Aus dieser Zeit stammt mein Respekt für die nicht-akademische Forschung. Auch in diesem Unternehmen nutzte ich dann aber die erste Gelegenheit, mich ins wissenschaftliche Abseits zu begeben: mit einer gleichwohl phänomenalen wie unbekannten Technologie, die mich bis heute begleitet; einer echten Wollmilchsau der Interaktionsanalysen, versatil, generisch, robust und präzise: Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS).

FCCS? Was bitte ist das denn?

Um zu verstehen, wie stark Wirkstoffmoleküle an ihre designierten Zielproteine in den Zellen binden, gibt es eine unüberschaubare Vielzahl von Messtechniken, denen gemeinsam ist, dass sie von gereinigten Proteinen abhängen. Damals wie heute ist das Reinigen von Proteinen gerne aufwendig, oft schwierig und nicht immer von Erfolg gekrönt.

Eine erhebliche Erleichterung stellt folglich ein Verfahren dar, das die Proteinreinigung einfach umgeht: Anstelle der Reinigung wird das Zielprotein lediglich als GFP-Fusion transient exprimiert und die exprimierenden Zellen zu kruden Lysaten verarbeitet.

Nach Inkubation mit einem ebenfalls fluoreszent markierten Inhibitormolekül kann die Interaktion bezüglich Bindungsstärke und kinetischen Konstanten direkt ausgelesen werden. Bei FCCS-Messungen wird ein mikroskopisch kleiner Detektionspunkt in der Probe von zwei überlappenden Laserlinien unterschiedlicher Wellenlänge ausgeleuchtet. Dieser Detektionspunkt, der durch Fokussierung des Lasers und Kombination mit konfokaler Optik entsteht, ist mit einem Volumen von weniger als einem halben Femtoliter kleiner als E.coli.

Fluoreszent markierte Moleküle, die durch dieses offene illuminierte Volumen diffundieren, werden angeregt – und emittieren Photonen, die auf hochsensitiven Detektoren aufgezeichnet werden. Bei niedrigen Teilchenkonzentrationen können Einzelmolekül-sensitiv die Diffusionsereignisse der Moleküle beobachtet werden, aus der Fluktuationsspur werden dann über Autokorrelation die Konzentration und die Diffusionsgeschwindigkeiten der Teilchen bestimmt. Bei simultaner Messung unterschiedlich Fluoreszenz-markierter Teilchen lassen sich zusätzlich Menge und Diffusionsgeschwindigkeit der Fraktion bestimmen, die als Komplex gebunden vorliegt (Kirsten Bacia & Petra Schwille, Nat Protoc. 2007;2(11):2842; Glauner et al.; Br J Pharmacol. 2010 Jun;160(4):958).

Aus all diesen Daten ergibt sich in einer einzelnen Messung über das Massenwirkungsgesetz die Dissoziationskonstante, Kompetition mit unmarkierten Molekülen erlauben IC50- und KI-Messungen; mit zeitaufgelösten Messungen sind kinetische Parameter zugänglich und als wissenschaftlicher Beifang geben die Datenspuren auch Hinweise auf Off-target Bindung, Komplexbildung und Stöchiometrie der beobachteten Interaktion.

Mit Messzeiten pro Datenpunkt von weniger als zwei Sekunden ist das Verfahren auch Hochdurchsatz-tauglich: Wollmilchsau eben!

Als im Jahr 2008 mein Arbeitgeber sich mit einer gescheiterten Phase 3 eines Krebsmedikaments versenkte (zu deutsch: er ging pleite), habe ich mit einem Kollegen die Firma Intana gegründet. Diese bietet kundenspezifische Assays auf Basis von FCCS an. In den sieben Jahren seither haben wir eine Reihe von Testverfahren für Pharmakunden aufgebaut und so zu Drug-Discovery-Projekten beigetragen, die sonst nur schwer hätten verwirklicht werden können. Die letzten beiden Jahre hat sich Intana der wohl kompliziertesten Proteinfamilie zugewandt – nämlich den GPCRs: eingebettet in die Plasmamembran, flexibel, multipel interagierend und intrinsisch instabil.

Da auch hier eine Reinigung nicht nötig ist und geringste Mengen für Messungen ausreichen, können besonders milde Verfahren genutzt werden, um die fragilen GPCRs schonend in Lösung zu bringen. In der Tat gelingt so auch für diese Proteinfamilie der Aufbau eines homogenen Bindungsassays und erlaubt die Bestimmung von Affinitäten und Kinetiken.

Ebenso wie ein eigener Lehrstuhl erlaubt auch ein eigenes Unternehmen, sich neue Themenfelder zu erschließen und als vielversprechende Geschäftsideen weiterzuentwickeln. Als sich vor Jahren mein Bruder (auch er Wissenschaftler) mit einer Idee zur Überwindung der inzwischen allgemein anerkannten Off-Target-Effekte von siRNAs an mich wandte, dachte die Welt noch, mit RNAi endlich den heiligen Gral der Gen-Funktionsanalyse gefunden zu haben.

Aus Sicht des wissenschaftlichen Leiters eines kommerziellen RNAi-Screening-Anbieters nahmen sich die Ergebnisse, die aus dem heiligen Gral ausgeschenkt wurden, allerdings wenig berauschend aus. Die Äußerung, dass ein Großteil der zellulären Antworten nach siRNA-Transfektion den unbeabsichtigt und unbemerkt (!) deregulierten Off-Targets zuzuschreiben sei, war häretisch und somit unerwünscht. Stattdessen wurden munter Millionen in verwegene RNAi-Screening-Projekte versenkt.

Inzwischen ist immerhin anerkannt, dass über die kurze Seed-Sequenz von siRNAs die Bindung von RISC an ein breites Spektrum vom Messages vermittelt werden kann. In Folge werden eine unüberschaubare Menge von mRNAs in ihrer Translation blockiert oder abgebaut – entsprechend sind auch heterogene zelluläre Antworten nicht weiter verwunderlich. Die Arbeiten aus der Feder von Eugene Buehler (J Biomol Screen March 2012 17: 370) und anderen zeigen eindrucksvoll, wie schwer interpretierbar die Ergebnisse aus solchen Screens sind.

Ein konzeptionell einfacher, aber sehr wirksamer Ansatz zur Lösung dieses fundamentalen Problems von RNAi besteht in der Verwendung komplexer Mischungen („Pools“) sorgfältig ausgewählter siRNA-Moleküle. Dabei sind alle siRNAs eines Pools gegen dasselbe Ziel-Gen gerichtet, divergieren aber in ihrer Seed-Sequenz und besitzen so unterschiedliche Off-Target-Effekte. Entsprechend wächst mit steigender Anzahl an siRNAs der erwünschte Effekt auf das Zielgen zunehmend während die störenden Off-Target-Effekte effektiv verdünnt werden.

Eine Reihe von Fragen sind mit dieser Idee verknüpft: Wie gut ist der Knock-Down, wenn unterschiedliche siRNAs genützt werden? Wieviele siRNAs sind nötig, um den Off-Target-Effekt komplett zu unterdrücken? Wie kann eine entsprechend große Anzahl genau definierter siRNA-Moleküle zu realistischen Kosten hergestellt werden?

In Zusammenarbeit mit der Universität und unterstützt von Fördermitteln haben wir diese Frage systematisch untersucht und die Ergebnisse 2013 veröffentlicht (Hannus et al., Nucleic Acids Res. 2014 Aug 1; 42(12): 8049). Wir konnten zeigen, dass die Nutzung komplexer siRNA-Pools („siPOOLs“) gegen ein gemeinsames Gen selbst bei niedrigsten transfizierten siRNA-Konzentrationen (0,2 nM) bessere KD-Effizienzen liefert als mit Single-siRNA-Reagenzien.

Eine Vielzahl von unabhängigen Untersuchungen zeigte darüber hinaus, dass eine Komplexizität von 30 siRNAs in einem Pool Off-Target-Effekte unter die Nachweisgrenze verdünnt. Um einen Pool von 30 siRNAs herzustellen, wurde ein Verfahren vorgestellt, das auf einer Kombination von synthetischer DNA-Template-Herstellung, In-vitro-Transkription, Hybridisierung, spezifischem Verdau und Reinigung beruht. Es zeigt sich, dass die siPOOLs besonders wirksam sind, um die neue Klasse langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs) abzubauen. Das Herstellungsverfahren erlaubt die kostengünstige Herstellung großer Mengen und ist deshalb attraktiv für In-vivo-Applikationen; momentan wird an den Möglichkeiten geforscht, stabilisierende Nukleotide in die siPOOLs einzubauen.

Zwischenzeitlich hat sich aus dieser Idee eine eigene Firma, die siTOOLs Biotech GmbH, etabliert, die mein Bruder gemeinsam mit dem Biochemiker Gunter Meister (Universität Regensburg) im Jahr 2013 gegründet hat.

Zum Ende komme ich zu einer eher unkonventionellen Anwendung der RNAi: der biotechnologischen Bekämpfung der Varroa-Milbe. Vor einigen Jahren habe ich nämlich begonnen, Bienen zu halten, und bin so mit dem Phänomen des Bienensterbens konfrontiert worden, über das 2006 zum ersten Mal in Europa berichtet wurde. Im gleichen Jahr wurde in den USA der Begriff „Colony Collapse Disorder“ (CCD) geprägt. Als Ursachen vermutet man die Nutzung von Pflanzenschutzmitteln und Insektiziden, aber auch eine Verschmälerung des Speisezettels der Bienen aufgrund landwirtschaftlicher Bodennutzung.

Unumstrittener Hauptverursacher aber ist die parasitische Milbe Varroa destructor. Seit diese in den 1970er Jahren aus Asien zunächst nach Europa und etwas später auch in die USA eingeschleppt wurde, hat sich dieser neue Bienenparasit zur globalen Bedrohung der Bienenzucht entwickelt. Die Varroa-Milbe parasitiert an adulten Bienen und Bienenbrut, schwächt dadurch die Bienen und fördert die Übertragung von Viren. In den USA und Europa ist quasi jedes Volk befallen; unbehandelt stirbt ein Volk innerhalb von zwei Jahren.

Die Biene gilt laut Bundesumweltamt nach Schwein und Rind als das drittwichtigste Nutztier in der Landwirtschaft und trägt durch die Bestäubung maßgeblich zur Ernährung der Weltbevölkerung bei. Namentlich die Produktion von Obst, Gemüse und Ölfrüchten ist in hohem Maße von Bienen abhängig. In den letzten Jahren allerdings ist der Bestand an Honigbienen durch Verluste von Bienenvölkern in vielen Regionen erheblich gefährdet; in vielen Regionen Europas ist die Bienendichte für eine effektive Bestäubung nicht mehr ausreichend. Bei einem kalkulierten ökonomischen Beitrag der Bienen zur Agrarproduktion von über 150 Milliarden Euro weltweit sind die wirtschaftlichen Auswirkungen dieses Bienensterbens erheblich.

Unabhängig von den globalen Problemen wollte ich meinen eigenen Bienen etwas Effektiveres, weniger Schädigendes anbieten als das Beträufeln mit Ameisen- und Oxalsäure, nach der man die Hälfte des Volkes tot vor dem Flugloch wegkehren kann. Das Studium der Fachliteratur brachte mich auf die Publikation von Yael Garbian et al., mit einem interessanten Ansatz gegen Varroa-Milben (PLoS Pathog. 2012 Dec;8(12): e1003035): Durch Fütterung der Bienen mit Zuckersirup, dem siRNAs gegen essentielle Varroa-Gene beigemischt wurden, hätten sie bis zu 60 Prozent der Milben abgetötet.

Die doppelsträngige RNA wird offenbar von den Bienen aufgenommen und verteilt sich systemisch über das gesamte Insekt. Sobald die Milben Hämolymphe aus Bienen saugen, nehmen sie auf diese Weise auch die RNA auf, die sich wiederum systemisch in der Milbe verteilt und in deren Zellen die Expression essentieller Gene unterdrückt. Eine elegante Idee, die moderne molekularbiologische Ansätze nutzt und intelligent den Wirt als Vektor nutzt, um den Parasiten zielgerichtet und hochselektiv zu bekämpfen!

Ausgestattet mit einem auf die Herstellung von RNAi-Reagenzien spezialisierten Labor hat die siTOOLs GmbH begonnen, nach Möglichkeiten zu suchen, die Methode zunächst zu reproduzieren und zu optimieren. Dazu kooperiert siTOOLs mit der Landesanstalt für Bienenkunde an der Universität Hohenheim – siTOOLs stellt die RNAs, die Landesanstalt verfügt über die nötige Erfahrung in der Testung von akariziden (= gegen Milben gerichteten) Wirkstoffen. Diese Aufgaben erwiesen sich als schwieriger als erwartet: Bienenforschung ist bemerkenswert aufwendig.

Tatsächlich ist es uns einerseits gelungen, die Daten von Garbian et al. zu bestätigen; andererseits sind wir aber auf einen alternativen Mechanismus gestoßen, der ebenso Milben abtötet, ohne dabei die Bienen zu schädigen. Die Resultate sind sehr frisch und mehr sei an dieser Stelle nicht verraten. Wenn sich allerdings dieses Projekt als so erfolgreich erweist wie es sich derzeit abzeichnet, freue ich mich, die Fortsetzung an dieser Stelle in einem Jahr weiterzuschreiben.

Vor dem Hintergrund meiner eigenen Laufbahn im Wissenschaftsbetrieb möchte ich somit abschließend einige Worte der Ermutigung sprechen: Es gibt ein Leben außerhalb der glänzenden akademischen Welt, und diese Welt ist durchaus spannend; vielfältig sowieso. Mein Weg zu einer eigenen Gruppe, zu unabhängiger Forschung und zur Selbstständigkeit war nicht eben geradlinig und schon gar nicht die Konsequenz überlegter Entscheidungen und geplanter Karriereschritte. Was mir an Genie fehlte, kompensierte ich mit Begeisterungsfähigkeit und Initiative sowie – jawohl! – viel Arbeit. Aber auch ein Arbeitssieg zählt.

Es geht also auch ungeradlinig. Man muss nicht immer der Schnellste, Jüngste und Beste sein: Ich selbst jedenfalls war das niemals. Und wenn ich etwas schätze an meinem anstrengenden Berufsleben, dann sind es die Möglichkeiten, die sich ergeben: Aus Kontakten mit vielen brillanten Akademikern; mit anderen Unternehmern, die etwas bewegen wollen; aus Ideen, die einem zufliegen, wenn man sich in den Wind stellt. Es gibt viele Wege aus dem Urschlamm.

Der Biologe Stefan Hannus ist Geschäftsführer der Intana Bioscience GmbH, Martinsried