Säugerzellen von Hand zu kultivieren, ist kein Zuckerschlecken. Die ständigen manuellen Medienwechsel und Zellpassagen machen eine Heidenarbeit und sind auch der Reproduzierbarkeit von Zellkultur-Experimenten nicht gerade zuträglich. Dies gilt insbesondere auch für dreidimensionale (3D-)Zellkulturen, etwa Sphäroide oder Miniorgane (Organoide), die Biowissenschaftler vermehrt einsetzen, um die Reaktion der Zellen zum Beispiel auf Wirkstoffe, regulative Substanzen oder Stressfaktoren zu testen.
Um die dröge Handarbeit zu vermeiden, versuchen viele Gruppen Experimente mit 3D-Zellkulturen so weit als möglich zu automatisieren. Wenn es der Geldbeutel zulässt, besorgen sie sich dazu Kultursysteme, die zumeist aus Slides oder kleinen Kulturkammern aus dem transparenten Kunststoff Polydimethylsiloxan (PDMS) bestehen. Über ausgeklügelt gesteuerte Mikrofluidik-Kanäle werden die darin kultivierten Sphäroide oder Organoide mit Medien versorgt und mit gewünschten Effektormolekülen behandelt.
Schwierige Ernte
Alle Wünsche der Zellkultivierer erfüllen aber selbst die ausgefeiltesten kommerziellen Organ-on-a-Chip-Systeme nicht. Häufige Schwachpunkte sind zum Beispiel die schwierige Ernte der Zellen aus den Mikrofluidik-Kammern oder die fehlende Möglichkeit, die Zusammensetzung von Medien oder zugeführten Substanzen während eines Versuchs zeitnah und dynamisch zu verändern.
Sebastian Maerkls Gruppe an der Eidgenössischen Technischen Hochschule Lausanne (EPFL) hat sich zusammen mit Matthias Lutolf vom Roche Institute for Translational Bioengineering in Basel überlegt, wie man diese Mankos beseitigen kann. Die Lösung der Schweizer ist eine einfach nachzubauende, bezahlbare Do-it-yourself (DIY)-Zellkultur-Plattform (ACCP) für die automatische Kultur von Stammzellen oder Organoiden, die die Zusammensetzung des Mediums sehr flexibel und praktisch in Echtzeit variieren kann.
Das ACCP-System besteht im Wesentlichen aus einer 24-Well-Platte für die Zellkultur, einem dazu passenden Plastik-Deckel sowie drei Mikrofluidik-Modulen. Eines der Module steuert den Zufluss der Medien aus zwei Vorratsbehältern, die beiden anderen den Abfluss in zwei Abfallbehälter. Die Herstellung des Deckels ist auch für technische Laien kein Problem. Man muss dazu lediglich drei kleine Löcher über den Wells der Platte bohren, die für die Zellkultur vorgesehen sind (die Gruppe nutzte zum Beispiel acht der 24 Wells). Anschließend versiegelt man die Löcher mit einer dünnen, elastischen PDMS-Folie und steckt die Enden von Teflonschläuchen durch die Folie in das Innere der Wells. Einer der Schläuche wird jeweils an das Zulauf-Modul angeschlossen, die zwei anderen an die Abfluss-Module.
Komplexe Konstruktion
Nicht ganz so einfach ist der Aufbau der Mikrofluidik-Module. Die Gruppe spricht zwar von „low-complexity, simple-to-fabricate, two-layer polydimethylsiloxane (PDMS) devices“. Die Konstruktion des sogenannten Pulse-Width-Modulation-Media-Formulator (PWM-MUX)-Moduls, das den Zufluss der Medien von den Vorratsbehältern in die einzelnen Wells der Zellkulturschale regelt, sieht aber schon etwas komplexer aus. Es enthält sechs sternförmig angeordnete, über dünne Teflonschläuche an verschiedene Medienbehälter angeschlossene Kanäle, die sich schließlich in einem Kanal vereinen. Kleine Ventile in dem Modul regeln den Zustrom aus den jeweiligen Medienbehältern und, wie lange die Medien fließen. Der Kanal mündet im MUX-Abschnitt des Moduls in ein fein verästeltes Kanalsystem, das die Medienmischungen oder jeweiligen Konzentrationsprofile über angeschlossene Teflonschläuche auf die einzelnen Wells der Kulturschale verteilt.
Ziemlich clever ist die Einstellung der Medien-Füllhöhe in den Wells. Dazu wird das Ende eines Teflonschlauchs, der über ein Abfluss-Modul mit dem eigentlichen Abfallbehälter verbunden ist, bis zum Wellboden geführt – das Ende eines zweiten auf gleiche Weise mit einem Levelling-Abfallbehälter verbundenen Teflonschlauchs steckt jedoch nur bis zur Höhe des gewünschten Pegelstands in den Wells. Beide Abfallbehälter sind an eine Vakuumpumpe angeschlossen. Ist im Abfluss-Modul das Ventil für den Abfallbehälter geöffnet, saugt die Pumpe das Medium bis zum Boden des Wells ab. Öffnet sich hingegen das Ventil für den Levelling-Abfallbehälter, fördert sie das Medium nur bis zum eingestellten Pegelstand aus dem Well.
Bereit zur Anwendung
Maerkls Mannschaft spielte mit dem automatischen DIY-Zellkultursystem zunächst verschiedene Szenarien für den Medienfluss durch, etwa regelmäßige zu festen Intervallen erfolgende Medienwechsel oder schrittweise stattfindende Konzentrationsänderungen von Medienzusätzen. Nach diesen Trockenübungen war das automatische Zellkultursystem bereit für die 2D-Kultur muriner embryonaler Stammzellen (ESC), die als Modell für die Entwicklung von naiven pluripotenten Zellen zu Epiblast-Zellen dienen.
Die Schweizer interessierten sich insbesondere für die Phase, in der sich die embryonalen Stammzellen zu Epiblast-ähnlichen Zellen (EpiLC) wandeln und danach den endgültigen Weg in Richtung Epiblast-Zellen einschlagen. Wann dieser „Point of no return“ überschritten ist, untersuchte das Team mithilfe des automatischen Zellkultursystems. Dazu programmierte es einen automatischen Medienwechsel in das ACCP-System ein, der dazu führte, dass ein EpiLC-induzierendes Medium schrittweise gegen ein sogenanntes 2i/LIF-Medium ausgetauscht wurde, das ESC-Zellen stabilisiert. Das Ergebnis dieses Experimentes deckte sich mit Resultaten anderer Gruppen: Wirkte das EpiLC-Medium 29 bis 35 Stunden auf die Zellen ein, ließ sich die Umwandlung zu EpiLC-Zellen auch durch das 2i/LIF-Medium nicht mehr umkehren.
Funktioniert auch in 3D
Jetzt musste die Gruppe nur noch zeigen, dass ihr automatisches Kultursystem auch für die 3D-Zellkultur geeignet ist. Als Versuchs-Objekte dienten in diesem Fall dreidimensionale Maus-Gastruloide, die Stammzellforscher als Modell für die frühe Embryogenese verwenden. Die birnenförmigen Gastruloide entwickeln sich aus kugelförmigen Aggregaten pluripotenter Stammzellen, wenn sie durch ein Wnt-Signal induziert werden. Hierzu wird der Wnt-Signalweg meist mit der Substanz Chiron aktiviert, die einen Wnt-Inhibitor hemmt.
Um verfolgen zu können, wie sich die Dauer des Wnt-Signals auf die Entwicklung von Gastruloiden auswirkt, züchteten die Schweizer die kleinen Zellhaufen mit dem ACCP-System in speziellen 3D-Wells. Anschließend ließen sie ein Chiron-haltiges Medium 8 bis 32 Stunden lang durch die Mikrofluidik-Kanäle fließen, um die Weiterentwicklung der Gastruloiden zu induzieren. Spätestens nach 28-stündiger Stimulierung mit Chiron begannen die kugelförmigen Gastruloide sich in die Länge zu strecken und Herz-ähnliche Strukturen zu bilden, die ebenfalls typisch für sich weiterentwickelnde Gastruloide sind.
Harald Zähringer
Tischler J. et al. (2022): An automated do-it-yourself system for dynamic stem cell and organoid culture in standard multi-well plates. Cell Reports Methods, 2(7):100244
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