Unter Pflanzenforschern scheiden sich die Geister, was wohl die geeignetste Methode zur DNA-Analyse über PCR sei. Die einen schwören auf Klassiker wie die CTAB-Methode, welche Cetyltrimethylammoniumbromid, eine Chloroform-Extraktion und Fällung mit Ethanol erfordert. Die anderen setzten auf kommerzielle DNA-Aufreinigungskits mit Säulchen und diversen Tinkturen.
Und dann gibt es noch eine dritte Partei, die auf Kosten und Zeit schaut und überzeugt ist, die DNA-Isolierung könne man sich ohnehin sparen. Ein Schnipselchen Gewebe im Reaktionsmix enhält schließlich genügend Zellen und somit auch DNA, um unmittelbar als Template zu dienen. Dieser Abkürzer der „direkten PCR“ spart Plastikmüll und Kreuzkontaminationsgefahr, welche in jedem Lösungstransfer-Schritt bei Aufreinigungsverfahren lauert. Er ist aber heikel. Schließlich kann ein Futzelchen zu viel Gewebe die Reaktion vereiteln, weil darin eben nicht nur DNA, sondern ein ganzes Sammelsurium potenzieller Inhibitoren steckt. „Weniger ist mehr“ lautet die Devise, denn solange die PCR spezifisch amplifiziert, macht man lieber ein paar Zyklen mehr und setzt weniger (Inhibitoren-trächtiges) Pflanzenmaterial ein. Gerade bei hohen Probenzahlen wie etwa beim Genotyping sind verlässliche Abkürzerstrategien gefragt.
Pipettenspitzen und Eis-am-Stiel
Luca Comai und sein Team von der University of California in Davis haben für die direkte PCR Optimierungsbedarf gesehen und sich überlegt, wie man möglichst einfach an Zellinhalte herankommt, Inhibitoren jedoch nicht die kritische Masse erreichen. Ihre Methodenentwicklung wird sukzessive minimalistischer. Am Anfang standen geschnittene (20µl-)Pipettenspitzen, die in ein Blatt gedrückt und dann unmittelbar in den PCR-Ansatz durch zehnmaliges auf und ab Pipettieren gespült werden.
Dann kam eine Methodenvariante, bei der die Pipettenspitze einfach gleich im Reaktionsansatz verblieb, oder vielmehr ein Teil der Spitze. Eine Spitze reicht für ein Dutzend Proben, weil sie scheibchenweise aufgebraucht wird: die Spitze pikst in Blatt 1 und wird über Reaktionsansatz 1 mit einer Schere gekürzt. Die gekürzte Spitze pikst in Blatt 2 … und so weiter. Als rückseitiger Widerstand dient ein Holzstab eines Eis-am-Stiel, entlang dessen man sich – mit genügend Abstand der einzelnen Pikspunkte – vorarbeiten kann.
Zweimaliges Waschen und Abwischen der Schere birgt allerdings die Gefahr von Kreuzkontaminationen. Noch einfacher geht es mit einer Angelsehne. Auch diese verbleibt direkt im PCR-Ansatz (10µl). Von diversen Fabrikaten haben sich alle als PCR-kompatibel erwiesen. Zur Vorbereitung kann man eine 0,28 mm dicke Angelsehne in ca. 4 mm kurze Stücke schneiden. Mit einer Pinzette schnappt man sich ein solches Stück, pikst es in ein Blatt und lässt es in den PCR-Ansatz fallen. Vorsicht, auch hier lauert Kontaminationsgefahr (Pinzette besser jedes Mal abwischen).
Gleiche Aussagekraft
Alternativ, und mit ein weniger Erfahrung, kann man auf eine noch feinere (die dünnste überhaupt verfügbare) Angelsehne umsteigen: 0,08 mm. Da sie durchsichtig und selbst mit der feinsten Pinzette schwer zu greifen ist, lässt man sie einfach erst einmal auf der Spule. Die Pinzette greift kurz über dem Schnurende an, welches nun ins Blatt pikst und abgeschnitten wird, um in den zugehörigen PCR-Ansatz zu fallen. Selbst ein zarter Keimling wird einen so hauchfeinen Piks schadlos überleben. Unterm Mikroskop zeigt sich, dass tatsächlich Pflanzenmaterial anhaftet.
Die Forscher haben die Pipettenspitz-Methode hinsichtlich Spezifität und Sensitivität an diversen Genabschnitten (ca. 400 bp) von Arabidopsis- und Reisblättern getestet; die Angelsehnen-Methode mit Arabidopsis, Kartoffel und Dotterlein, und dabei auch auf etwaige Kreuzkontamination geachtet. Die trat nicht auf. Mit 33 bis 40 Zyklen hat so eine direkte PCR die gleiche Aussagekraft wie eine, die über den mühsamen CTAB-Weg geht. Wer größere Genotypisierungsprojekte plant, sollte seine Angelsehnenstücke besser in PCR-Gefäße mit Wasser deponieren und erst am Ende zu allen Proben den PCR-Mastermix hinzugeben. In Wasser sind die Templates langlebiger (>24 Stunden).
Andrea Pitzschke
Lynagh P. et al. (2022): Accurate Direct PCR with Arabidopsis and rice. BioRxiv, DOI: 10.1101/2021.07.16.452406
Bild: Pixabay/GA_Melon
