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Hinter Schloss
und Riegel

(02.02.2022) Wenn sich eine Zielsequenz nur schwer mit CRISPR-Cas9 editieren lässt, ist meist eine fehlgefaltete gRNA schuld. Die Lösung: eine verriegelte gRNA.
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Selbst wenn man viel Routine hat und ein Transfor­mations-Genie ist, funktioniert das Genom-Editing mit CRISPR-Cas9 mal mehr und mal weniger gut. Diese Unberechen­barkeit ist häufig auf einzelne Struktur­elemente der eingesetzten guide-RNA (gRNA) zurückzuführen. In der Natur besteht die gRNA aus einem Duplex aus CRISPR-RNA (crRNA) und trans-aktivierender crRNA (tracrRNA). Die crRNA enthält eine zwanzig Nukleotide lange Ziel-spezifische Spacer-Sequenz (Guide-Sequenz) sowie eine daran anschließende Repeat-Sequenz, die teilweise homolog ist zur Anti-Repeat-Sequenz der tracrRNA und mit dieser hybridisiert. Auf die Anti-Repeat-Sequenz der tracRNA folgen drei Haarnadel­schleifen (Hairpins), die für die korrekte Faltung und Funktion der gRNA entscheidend sind: der sogenannte Nexus sowie Hairpin 1 und 2. Das Gleiche gilt auch für synthetische single-guide-RNAs (sgRNA), bei denen crRNA und tracrRNA durch eine kurze Schleife künstlich miteinander verbunden sind.

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Goldene RNA

Probleme mit den Hairpins können zu Fehlfaltungen der gRNA führen, die die Effizienz des Editings massiv beeinträchtigen, etwa weil die Spacer-Sequenz statt mit der Ziel-Sequenz mit einem Teil des zweiten Hairpins der tracrRNA hybridisiert. Um diese Fehl­faltungen auszuschließen, entwickelte Svante Pääbos Team am Max-Planck-Institut für evolutionäre Anthropologie in Leipzig sogenannte Genome editing Optimized Locked Design (GOLD)-gRNA, die sich korrekt faltet und in diesem Zustand verriegelt wird. Das Design der GOLD-gRNA folgt der Grundidee, dass ein kleinerer Sequenz-Abschnitt zu Beginn der Faltung eine möglichst stabile Hairpin-Struktur einnimmt, von der aus wie bei einem Kristalli­sationskeim die weitere korrekte Faltung bis zur fertigen GOLD-gRNA fortschreitet.

Das Team nahm sich hierzu den Hairpin 1 der tracRNA vor, der unmittelbar an den Nexus anschließt. Es fügte spiegel­symmetrisch einige jeweils komplementäre Nukleotide zu der Schleife hinzu, sodass eine längere Haarnadel mit höherer Schmelz­temperatur entstand (71°C). Diese sogenannten locked tracrRNAs (t-lock) kombinierte die Gruppe mit verschiedenen crRNAs und editierte mit ihnen zehn Zielsequenzen in pluripotenten, Cas9-exprimierenden Stammzellen. Gegenüber nicht-manipulierten tracRNAs war die Editier-Effizienz der locked tracrRNAs durchschnittlich 1,7-fach höher und übertraf auch die Effizienz chemisch-modifizierter tracrRNA um das 1,3-Fache.

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Nicht übertreiben!

Auch bei sgRNA schneidet die t-lock-Variante besser ab als die nicht-modifizierte sgRNA. Die gRNAs können als in vitro transkribierte Moleküle eingesetzt oder direkt in Zellen in vivo transkribiert werden – in beiden Fällen ist das Editing mit den verriegelten Varianten effizienter.

Mit dem „einsperren“ sollte man es aber nicht übertreiben. Brachten die Leipziger ähnliche Verlängerungen an weitere Hairpins an, erwies sich dies als kontra­produktiv. Besser ist ein zusätzliches Upgrade durch chemische Modifikationen. Schutz vor dem Verdau bieten zum Beispiel endständige Phosphor­thioat-Gruppen (PTO) sowie interne Methylierungen in Form von 2‘-OMe-Modifi­kationen der freien 2‘-OH-Gruppen. Die Methylierungen sollten aber nicht in dem Sequenz-Abschnitt liegen, an den Cas9 bindet, denn an der Interaktion sind freie 2‘-OH-Gruppen beteiligt.

Die (GOLD)-tracRNA der Leipziger mit verlängertem Hairpin, endständigen PTO-Gruppen sowie internen Methy­lierungen ist universell für das Genom-Editing geeignet. Bei mehreren schwierig zu editierenden genomischen Zielsequenzen konnte Pääbos Team die Editier­effizienz mit der GOLD-gRNA durchschnittlich um das 7,4-Fache erhöhen, im extremsten Fall sogar um das Eintau­sendfache. Aufgrund von Ergebnissen mit elektro­phoretischen Mobilitäts­verschiebungs-Assays vermutet die Gruppe, dass die verriegelten gRNA-Varianten stärker mit Cas9 interagieren, was letztlich zu einer höheren Effizienz des Editings führt. Um eventuell damit einhergehende Off-target-Effekte zu vermeiden, raten die Leipziger dazu, exakt arbeitende High-fidelity-Cas9 zu verwenden.

Andrea Pitzschke

Riesenberg, S. et al. (2022): Improved gRNA secondary structures allow editing of target sites resistant to CRISPR-Cas9 cleavage. Nature Communications, 13:489

Bild: Pixabay/Broesis