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Günstig in der Hand
amplifiziert

(05.01.2022) Ein simpler SARS-CoV-2-Test verknüpft die isothermale RNA-Amplifikation sehr smart mit der Steuerung der Genexpression durch Riboregulatoren.
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RNA in einer Probe schnell, spezifisch und mit möglichst wenig Aufwand detektieren zu können, hat nicht nur im Wettlauf gegen SARS-CoV-2 höchste Priorität. Wer keine Hightech-Ausstattung zur Verfügung hat, muss umso kreativer mit molekular­biologischen Methoden und den vorhandenen Labor-Geräten umgehen können. Dazu zählt etwa, auf PCR sowie Thermo­cycler zu verzichten und die RNA isothermal zu amplifizieren. Zusätzliches Einspar­potenzial entsteht, wenn man einzelne Komponenten mit einem zellfreien Transkrip­tions-/Transla­tionssystem selbst herstellt, statt sie online zu bestellen.

Omer Duhan Toparlaks Team von der Universität Trento in Italien hat diese Spar­maßnahmen geschickt zu einem SARS-CoV-2-Testver­fahren kombiniert. Für dieses macht sich die Gruppe zwei Prinzipien zunutze: die Regulation der Genex­pression mit sogenannten „toehold switch-mediated Ribore­gulatoren“ sowie die alpha-Komple­mentation der vom LacZ-Gen codierten b-Galacto­sidase. Toehold switch-mediated Ribore­gulatoren sind Nukleinsäure-Strukturen, die sich aufgrund ihrer Sequenz zu komplizierten Gebilden aus mehreren Stem-Loop-Strukturen verbinden und hierdurch die Translation nachfolgender Sequenz­abschnitte vereiteln. Sie öffnen sich nur, wenn passende Trigger-DNAs oder Trigger-RNAs an sie binden und hierdurch die Translations-Blockade lösen.

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UTRs gesucht

Um SARS-CoV-2-RNA mit der Technik detektieren zu können, identifizierten die Italiener zunächst in silico mögliche Ribore­gulator-Strukturen mithilfe des RNAfold-Servers der Universität Wien und suchten dazu passende SARS-CoV-2-RNA-Abschnitte. Letztere sollten vorzugsweise aus untrans­latierten Regionen (UTR) des Virusgenoms stammen, da die Synthe­serate von UTRs meist viel höher ist als die codierender Sequenzen. Der Hinter­gedanke: Je mehr einer RNA-Spezies in der Probe vorliegt, umso einfacher sollte sie zu detektieren sein. Nach einiger Vorauswahl fand die Gruppe schließlich die optimale Konstellation von Ribore­gulator-Sequenz und UTR-Spezies.

Mithilfe einer dreißig­minütigen Recombinase Polymerase Amplification (RT-RPA) wird die UTR-Sequenz in der RNA-haltigen Probe zunächst vervielfältigt. Die hierzu nötige Temperatur von 37 bis 42 Grad Celsius liefert notfalls die eigene Körper­wärme – man muss dazu lediglich das verwendete Reak­tionsgefäß in der geschlossenen Hand halten.

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Besser Mutanten verwenden

Die weiteren Komponenten des SARS-CoV-2-Detektors mit Toehold-Regulator gewannen die Italiener aus Zellextrakten manipulierter E.-coli-Zellen. Ihr Konstrukt besteht aus dem T7-Promotor, dem Toehold-Ribore­gulator sowie einem Fragment des LacZ-Gens, das für das alpha-Peptid der b-Galactosidase codiert. Aufpassen muss man bei der Wahl des E.-coli-Stamms: Die für Expressionen standardmäßig eingesetzten BL21-Derivate kommen nicht infrage, da sie von Haus aus ein LacZ-Gen mitbringen. Deshalb sollte man auf LacZ-Mutanten ausweichen, beispielsweise JM109 oder DH10b.

Damit das a-Peptid von dem Konstrukt exprimiert wird, müssen genügend Kopien der viralen UTR-Sequenz vorliegen. Außerdem muss die fehlende Komponente b-Galacto­sidase-w mithilfe eines MBP-Fusions­proteins ergänzt werden. Das von diesem exprimierte b-Galactosidase-w-Fragment ermöglicht die alpha-Komple­mentation, wodurch sich ein funktions­fähiges b-Galactosidase-Tetramer bilden kann.

Ergebnis nach zehn Stunden

Der SARS-CoV-2-Test der Italiener findet in 96-Well-Platten auf Filterpapier­scheiben statt. Hierfür wird das Filterpapier zunächst mit BSA blockiert und luftgetrocknet. Anschließend pipettiert man vier Zutaten in jedes Well: den Rohextrakt von E. coli mit dem beschriebenen Konstrukt, rekombinante b-Galacto­sidase-w, das Farbstoff­substrat CPRG (Chlor­phenol-red-b-D-Galacto­pyranosid) sowie die zu analysierende Probe. Im positiven Fall wechselt die Farbe auf dem trocknenden Filterpapier von gelblich-orange zu rötlich-orange. Bei Raum­temperatur und Lufttrocknung steht das Ergebnis spätestens nach zehn Stunden fest.

Das Verfahren ist zwar noch nicht ganz ausgegoren, insbesondere was die Optimierung des Puffers betrifft. In Speichelproben, die amplifizierte SARS-CoV-2-RNA in verschiedenen Konzen­trationen enthielten, funktionierte der Test aber und war relativ sensitiv – das Detekti­onslimit entspricht etwa einem Ct-Wert der qPCR von 29. Der Preis von nur 23 Cent pro Test spricht ebenfalls dafür, die Technik weiter zu optimieren.

Andrea Pitzschke

Notarangelo M. et al. (2021): Inexpensive and colorimetric RNA detection by E. coli cell-free protein synthesis platform at room temperature. medRxiv, DOI: 10.1101/2021.11.29.21267025

Bild: Pixabay/Comfreak & Innovative Genomics Institute, UC Berkeley (RNA)