Test bestanden

Horizontal, vertikal: völlig egal

An größere Mengen reiner RNA-Moleküle zu gelangen, verlangt sauberes und zügiges Arbeiten. Egal, ob die RNA aus einer extrahierten biolo­gischen Probe, einer In-vitro-Transkription oder einer anderen Quelle stammt: Das Damokles­schwert des nukleo­lytischen Abbaus schwebt immer über ihr und man muss zudem Proteine und sonstige Fremdstoffe loswerden.

Aufgetrennt wird RNA meist in Polyacrylamid-Gelen. Die sind aber wesentlich schwerer zu knacken als Agarosegele, die man nur schmelzen und mit chaotropen Substanzen in eine Lösung bringen muss, um die darin gefangenen Nuklein­säuren präzipitieren oder über Säulchen aufkonzentrieren zu können.

Identisch, aber doch anders

Für RNA-Präparationen ist die Polyacrylamid-Gelelektro­phorese (PAGE) mit anschließender Elektro­elution oft das Mittel der Wahl. Bei der Elektro­elution wandert die negativ geladene RNA zum positiven Pol und wird dort entnommen. Obwohl das Arbeits­prinzip der Elektro­elutions-Geräte identisch ist, unterscheiden sich die Modelle je nach Hersteller merklich. Was aber, wenn man sich auf ein Gerät eingeschworen hat, die Produktion jedoch eingestellt wurde oder Ersatzteile nirgends mehr aufzutreiben sind? Kann es dann mit einem anderen Elektroeluter böse Überraschungen geben?

Um diese Frage zu klären, verglich Ana Maria Sotos Gruppe von der Towson University, USA, zwei grundver­schiedene Modelle hinsichtlich Ausbeute und Unversehrtheit der eluierten RNA. Als Probe verwendete Sotos Team jeweils eine 172 Nukleotide lange, in-vitro-transkribierte RNA mit recht komplizierter Sekundär­struktur (M-box riboswitch von M. tuberculosis). Um beim Quantifizieren mittels Absorptions­messung bei 260 Nanometern keine Faltungs- und Aggregations-bedingten Haus­nummern zu messen, erhitzte das Team die Proben auf 85 °C und trennten sie danach in einem 14-prozentigen Harnstoff-Polyacrylamid-Gel in einem TRIS-Borat-EDTA-Puffer (TBE). Auch bei der Elution verwendete die Gruppe TBE anstelle eines Tris-Acetat-EDTA(TAE)-Puffers.

Horizontal oder vertikal getrennt

Der getestete Elutrap-Elektroeluter trennt die Proben horizontal in einer länglichen Apparatur auf, die einer Elektro­phorese-Kammer ähnelt. Dafür platziert man das Gelstück mit der RNA in eine längliche Kammer zwischen Kathode und Anode, die jeweils durch eine undurch­lässige Membran von der Elutions-Kammer getrennt sind. Am Pluspol befindet sich ein kurzer Abschnitt der Kammer, in den die eluierte RNA über eine permeable Membran nach Anlegen der Spannung einwandern kann. Aus dieser entnahm die Gruppe Proben nach einer, zwei sowie drei Stunden, poolte sie und konzentrierte sie auf.

Beim dem ebenfalls von der Gruppe getesteten vertikalen Elektroeluter werden die Gelstücke in einen stehenden Glaszylinder gelegt, dessen Boden mit einer Fritte verschlossen ist. Die RNA bewegt sich von oben nach unten durch die Fritte und landet in einem aufsteckbaren Silikon­adapter, der unmittelbar an die Fritte anschließt und als Sammel­gefäß dient. Eine impermeable Membran am Geräteboden verhindert, dass die RNA aus dem Gefäß ausbüxt. Auch hier funktionierte ein TBE-Puffer genauso gut wie ein TAE-Puffer. Da die Leit­fähigkeit des TBE-Puffers geringer ist, reduziert dieser zudem die Überhitzungs-Gefahr. Das stündliche Entleeren der Sammel­kammer ist angesichts der vertikalen Konstruk­tionsweise aufwendiger als bei der horizontalen Variante. Alternativ kann man die Sammel­kammer auch erst nach drei Stunden entleeren und nimmt dafür circa ein Fünftel weniger Ausbeute in Kauf - die Forscher vermuten, dass einige RNA-Moleküle im Verlauf der Zeit an der Membran irreversibel hängen bleiben.

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Beide gut

In dem Vergleich schnitten beide Geräte letztlich ähnlich gut ab. Leert man die Sammel­kammer nach einer, zwei sowie drei Stunden, findet man in beiden Fällen etwa 70 Prozent der RNA wieder.

Problematisch ist die Elution der RNA aus PAGE-Gelen von Hand, etwa mit der Crush/Soak-Technik, bei der die Gelstücke in Tris-EDTA mit einer Pipetten­spitze zertrümmert, mehrfach eingefroren, wieder aufgetaut und dann 12 Stunden bei 37 °C und sporadischem Vortexen inkubiert werden. Da ist es dann kein Wunder, dass die eluierte RNA gehörig degradiert ist. Auf einem analytischen Harnstoff-PAGE-Gel sieht die Spur aus, als hätte man Größenmarker gepoolt laufen lassen. Die elektro­eluierten RNAs erscheinen hingegen als eine fette Bande.

Andrea Pitzschke

Rogers A. et al. (2021): RNA electroelution: Comparing two electroeluter models. Analytical Biochemistry, 632:114391

Bild: Whatman