Lateral Flow Assays, kurz LFA, erleben dank SARS-CoV-2 einen weltweiten Boom. Sie werden aber schon lange als leicht handhabbares Werkzeug zum Nachweis von Hormonen-, DNA-, Antigenen- oder Antikörpern in Urin-, Blut- oder Umweltproben eingesetzt. Sie bestehen fast immer aus einer Nitrocellulose (NC)-Folie, auf der in wenigen Zentimetern Abstand Test- und Kontrolllinien mit immobilisierten Antikörpern oder anderen Capture-Molekülen aufgebracht sind. Als Startpunkt dient ein sogenanntes „Sample Pad“, das Antikörper – oder Antigene enthält, die meist mit entsprechenden Goldnanopartikeln konjugiert sind. Die Probenflüssigkeit wird auf das „Sample Pad“ aufgetragen und löst die Nanopartikel-Konjugate aus dem „Sample Pad“ heraus. Anschließend wandert die Flüssigkeit zu einem „Absorption Pad“ am anderen Ende des NC-Teststreifens. „Sample“ und „Absorption Pad“ bestehen zumeist aus Cellulose, der eigentliche Teststreifen dagegen aus Nitrocellulose.
Wandernde Flüssigkeiten
Eine Gruppe um Harald Kolmar von der TU Darmstadt und Gerhard Schwall vom Merck Lab an der TU Darmstadt fragte sich, ob dieser teure und nicht besonders umweltschonende Materialmix tatsächlich nötig ist. Schließlich ist Nitrocellulose nicht das einzige Matrixmaterial, durch das aufgesaugte Flüssigkeiten wandern und mitlaufende Moleküle transportieren können. Das geht auch mit Cellulose. Die wäre wesentlich billiger und auch nicht so knickanfällig wie Nitrocellulose. Aber wie lassen sich Antikörper auf einem Teststreifen aus Cellulose immobilisieren? Einfach nur auftropfen und trocknen lassen funktioniert nicht, denn die vorbeiziehende Probenflüssigkeit würde die Antikörper teilweise erfassen und mitnehmen. Die Testlinie beziehungsweise das Signal würde hierdurch verschwimmen – die Antikörper müssen deshalb in der Cellulose verankert werden.
Den geeigneten Papieranker fanden die Darmstädter Forscher im Cellulosom des Mikroorganismus Clostridium thermocellum, das seinen Energiehaushalt mit dem Zerlegen von Papier bestreitet. Die Gruppe exprimierte das knapp 20 kDa große Carbohydrate Binding Module (CBM) des Cellulosom-Komplexes als rekombinantes Fusionsprotein mit verschiedenen Einzelketten-Antikörper-Fragmenten (CBM-scFV) oder kompletten Antikörpern (CBM-IgG).
Antikörper mit Schwänzchen
Dass CBM sich tatsächlich an die Cellulosematrix krallt bewiesen Tests mit radioaktiv markierten (125I) Proteinen. Im Dot-Spot-Prinzip setzten die Forscher Tröpfchen auf ein präpariertes Papier, das bis auf die regelmäßigen Aussparungen von einer Wachsschicht überzogen war. Nach Antrocknen sowie mehrmaligem Waschen – wahlweise in Puffer (TBS) mit BSA, Tween-20 oder Casein – maßen sie die Radioaktivität. Auf Cellulose hafteten Antikörper mindestens doppelt so stark, wenn sie mit einem CBM-Schwänzchen ausgestattet waren.
Die Darmstädter testeten drei Papierqualitäten mit unterschiedlich schnellem Kapillarfluss (C60, C120, C180), die in etwa den klassischen NC-Membranen (HiFlow75, HiFlow120, HiFlow180) entsprechen. In einer Verdünnungsreihe mit dem Schwangerschaftshormon hCG schnitt C120 am besten ab. Das Team wählte dieses Papier schließlich für einen „Corona-Teststreifen“ aus, der Antikörper gegen SARS-CoV-2 detektiert.
Doppelt gut
Mithilfe der CBM-Fusionen verankerten die Forscher CBM-scFv oder CBM-anti-hIgG auf den Teststreifen aus Papier, die als Detektions-Antikörper für SARS-CoV-2 spezifische Antikörper dienten. Auf diese Weise konnten sie positive Serumproben erkennen, wenn diese mindestens 125 Nanogramm anti-SARS-CoV-2-Antikörper enthielten.
Die Darmstädter vermuten, dass der CBM-Anker eine Doppelrolle übernimmt. Neben der Haftung an Cellulose sorgt er offensichtlich auch für eine günstige Ausrichtung der an ihm hängenden Antikörper.
Andrea Pitzschke
Elter A. et al. (2021): Carbohydrate binding module-fused antibodies improve the performance of cellulose-based lateral flow immunoassays. Scientific Reports, 11:7880
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