Während die von der Pandemie zermürbte Menschheit sich mit der Impfstoffknappheit herumschlägt, wächst an der Universität für Bodenkultur (BOKU) in Wien vielleicht schon ein SARS-CoV-2-Therapeutikum in Tabakpflanzen heran. Eine vielköpfige Gruppe um den Pflanzenbiotechnologen Richard Strasser exprimierte eine lösliche Variante des Angiotensin-konvertierenden Enzyms 2 (ACE2) in Tabak. Diese frisierte Version (ACE2-Fc) soll SARS-CoV-2 von den auf der Zelloberfläche exprimierten ACE2-Molekülen weglocken, die dem Virus als Türöffner in die Wirtszellen dienen.
Humanes ACE2 ist sehr üppig glykosyliert, Bakterienkulturen kamen deshalb für die rekombinante Expression nicht in Frage. Deutlich besser geeignet sind pflanzliche Expressionssysteme, etwa die Tabakpflanze Nicotiana benthamiana – wenngleich die Glykosylierung auch in dieser nach etwas anderen Spielregeln abläuft als in tierischen Zellen.
Modifizierter Mechanismus
Pflanzenforscher haben die Glykosylierungs-Mechanismen in N. benthamiana jedoch modifiziert. Durch den Knockdown der Gene für Fucosyltransferase und Xylosyltransferase versetzten sie die transgene Tabaklinie delta FT/NT in die Lage, rekombinante Glykoproteine mit einem humanen Glykan-Muster zu produzieren. Auch der Faktor Zeit spricht für Tabak: Die mit Agrobakterien infiltrierten Blätter fahren die Proteinproduktion sofort hoch und sind innerhalb von vier Tagen erntereif.
Mit einem Trick erhöhten die Wiener die Stabilität des löslichen ACE2. Sie exprimierten das Codon-optimierte ACE2 als Fusion mit dem Fc-Fragment von humanem Immunoglobulin G. Dies erleichterte nicht nur die Reinigung aus den Tabakblättern. Durch das kleine Anhängsel wird das lösliche ACE2-Fc auch stabilisiert (siehe dazu: Nat Commun, 11(1):2070). Zudem veränderte die Gruppe die ACE2-Sequenz in der sogenannten „Hinge“-Region. Dies sollte verhindern, dass ACE2-Fc während der Expression pflanzlichen Proteasen zum Opfer fällt.
Routinierte Isolation
Ab hier war vieles Routine. Aus Tabakblättern, die ACE2-Fc transient exprimierten, gewannen die Biotechnologen einen Proteinextrakt und trugen diesen auf Protein-A-Affinitätssäulen auf, um ACE2-Fc zu isolieren. Mit einer präparativen Größenausschluss-Chromatographie erhielt ACE2-Fc anschließend den letzten Schliff. Als Vergleich für die weiteren Experimente verwendete die Gruppe rekombinantes ACE2-Fc aus HEK293-Zellen.
Deglykosilierungs-Mobilitätsshift- und LC-ESI-MS-Analysen ergaben, dass sich das Glykosylierungs-Muster von ACE2-Fc aus Tabakpflanzen nicht wesentlich von dem in HEK293 produzierten ACE2-Fc unterschied. Dass in jedem zehnten ACE2-Fc-Protein aus Tabak eine der sechs N-Glycan-Positionen (N90) unmodifiziert ist, könnte sogar ein Vorteil sein, denn diese Variante scheint stärker an das Spike-Protein von SARS-CoV-2 zu binden (siehe dazu: Science, 369(6508):1261-5).
Natürliches ACE2 ist für die Blutdruck-Regulation zuständig (siehe dazu auch ein Interview mit Michael Bader) und arbeitet als Zink-Metallo-Peptidase. ACE2-Fc aus Tabak spaltete ein synthetisches fluorogenes Peptidsubstrat genauso gut, wie das in HEK-293-Zellen exprimierte Protein. Auch dies spricht für die korrekte Faltung und Funktion von Tabak-ACE2-Fc. Bleibt noch die alles entscheidende Frage: Wie schlägt sich das in Tabak exprimierte ACE2-Fc als Lockvogel für SARS-CoV-2.
Virus-Vermehrung verhindert
Dass ACE2-Fc an das Virus bindet, zeigten die Wiener in einem Sandwich-ELISA. Dazu immobilisierten sie ACE2-Fc auf ELISA-Platten und inkubierten diese mit verschiedenen Konzentrationen der Rezeptor-Bindedomäne (RBD) des Spike-Proteins. Tatsächlich band in Tabak exprimiertes ACE2-Fc etwas stärker an die RBD als die aus HEK293-Zellen stammende Variante. Auch Neutralisations-Tests, bei denen SARS-CoV-2 mit ACE2-Fc versetzt und dann auf Vero E6-Zellen losgelassen wurde, sehen vielversprechend aus. Laut qRT-PCR-Daten verhindern beide ACE2-Fc-Varianten die Vermehrung des Virus gleich gut.
Andrea Pitzschke
Castilho A. et al. (2021): Generation of enzymatically competent SARS-CoV-2 decoy receptor ACE2-Fc in glycoengineered Nicotiana benthamiana. Biotechnol J, e2000566
Bild: Emw - Eigenes Werk, CC BY-SA 3.0 (ACE2) & Pixabay/Skitterphoto (Mausefalle)
