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Angezuckerte PCR

(02.09.2020) Mit dem Disaccharid Trehalose lässt sich die PCR schon wirkungs­voll verstärken. Noch besser und schneller geht‘s mit Sukrose.
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Wann immer bei PCRs hohe Effizienz und Spezifität ausschlag­gebend für den Erfolg sind, greift man gern zu hoch­leistungs­fähigen Spezial-Polymerasen und auch um einiges tiefer in die Tasche. Wirtschaft­licher und einfacher könnte es aber sein, die Alltags-Taq zu höherer Leistung zu motivieren.

Das geht gewöhnlich mit sogenannten „Enhancern“, welche entweder als Geheim­rezeptur aus kommerzieller Quelle oder vom Griff ins Chemi­kalienregal her stammen. Hier gibt es eine Vielzahl an Substanzen, deren positive Effekte beispiels­weise darauf beruhen, die Schmelz­temperatur von DNA zu senken (DMSO), das Durchhalte­vermögen der Polymerase zu fördern (Trehalose) oder DNA und Polymerasen zu stabilisieren (Detergenzien, BSA).

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Gut versteckt?

„Irgendwie seltsam“, fanden Forscher der Russischen Akademie der Wissen­schaften, dass Trehalose, aber keinem einzigen anderen Kohlen­hydrat eine „Enhancer“-Wirkung zuge­schrieben wird. Vielleicht verbirgt sich ja unter den Mono- und Disacchariden noch ein viel potenterer Akteur?

Systematisch nahmen sie die Frage in Angriff. Zunächst ließen sie verschiedene Polymerasen (AmpliTaq, Phire, Phusion HF, Taq) im Vergleich antreten – alle ohne „Enhancer“. Hier zeigten sich die zu erwartenden Unter­schiede an Produkt­mengen (Endpunktanalyse: ein 525 bp Produkt).

Die normale Taq brachte nur einen geringen Ertrag, der sich nochmals reduzierte, wenn EvaGreen im Reaktions­mix enthalten war. In Gegenwart von SYBR Green schlug die Normalo-Taq gänzlich fehl. Offenbar kam sie mit inter­kalierenden Farb­stoffen nicht klar. Um diese Schwach­stelle zu beheben, testeten die Russen neben DMSO (als „Enhancer“-Kontrolle quasi) verschie­dene Mono- und Disaccharide (Trehalose, Sukrose, Laktose, Glukose, Mannose, Galaktose, Fruktose sowie Inulin und Ficoll 400) in Konzen­trationen von 2–10 %. Für sämtliche qPCR-Experimente mit EvaGreen als Farbstoff bestimmten sie die Ct-Werte, machten Schmelz­kurvenanalysen und schauten per Gel-Elektro­phorese die Produkt-Zusammen­setzung genau an. Ganz klar die Nase vorn hatte Sukrose.

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Kaum Artefakte

Egal ob 2-, 4-, 6-, 8- oder 10-%ig dosiert, brachte eine „gesüßte“ Reaktion wesent­lich mehr vom gewünschten Reaktions­produkt (525 bp, hoher GC-Gehalt) hervor, ohne dabei nennens­werte Artefakte zu generieren. Der Ct-Wert lag hier um 4–6 Zyklen unter jenem der „Ohne-Enhancer“-Vergleichs­reaktion. Andere „Enhancer“ führten dagegen entweder zu gar nichts (Ficoll) oder steigerten die Reaktions­effizienz auf Kosten von Neben­produkten (z. B. DMSO, Mannose).

Bewährt sich der Top-Kandidat Sukrose aber auch bei anderen und größeren Heraus­forderungen? Experimente zur Amplifi­kation von unter­schiedlich langen Fragmenten (342 bp, 525 bp, 1 kb, 3 kb) zeigen einen klaren Trend an: Sukrose verbessert die Effizienz der PCR bei hoher Spezifität (keine Artefakte). Je länger das Produkt jedoch, desto geringer ist die Verstärker­wirkung.

Andrea Pitzschke

Sakhabutdinova A. et al. (2020): Enhancement of PCR efficiency using mono- and disaccarides. Anal Biochem, 606:113858

Foto: Pixabay/moritz320




Letzte Änderungen: 02.09.2020

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