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Miniprep für Minimalisten

(26.08.2020) In Plasmid-Minipreps wird meist RNase A eingesetzt, um störende RNA zu entfernen. Das kann man sich schenken, wenn man die alkalische Lyse der Zellen modifiziert.
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An Standard­protokollen, die über Forscher­generationen hinweg in jedem Labor funktionieren, gibt es eigentlich nichts zu rütteln. Dennoch kann es sich lohnen, sich selbst ein so etabliertes Routine­verfahren wie die Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien mit Miniprep-Kits nochmal genauer anzuschauen. Ian Hu, Algen­forscher und Gründer des britischen Start-ups Phycobloom, störte insbesondere der hohe Preis kommer­zieller Miniprep-Kits. Er entwickelte deshalb den „Macerprep“, der auf selbst hergestellten Puffern und Lösungen, Nullacht­fünfzehn-Spinsäulen sowie der alkalischen RNA-Hydrolyse basiert.

Miniprep-Kits enthalten in der Regel eine Handvoll Puffer­lösungen sowie kleine Silica-Spinsäulen. Die Zellen werden zunächst in Puffer 1 (P1) suspendiert und anschließend durch alkalische Hydrolyse in Lysepuffer (P2) aufgeschlossen. Danach wird das geklärte Lysat mit einer Guanidinium­chlorid-haltigen, sauren Neutrali­sierungslösung (N3) versetzt, die meist zusätzlich RNase A enthält. Das chaotrope Guanidinium­chlorid löst die Wasserstoff­brücken zwischen DNA und Wasser, wodurch die DNA-Moleküle gezwungen werden, an die Silica-Oberfläche zu binden. Anschließend entfernt man das Guanidinium­chlorid mit einem ethanol­haltigen Waschpuffer und eluiert die DNA schließlich mit einem wässrigen Puffer von der Säule.

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Größere Ausbeute mit einfachem Trick

Mini-, Midi- oder Maxiprep-Kits liefern zwar im Handum­drehen saubere Plasmid-DNA, ihre Ausbeuten lassen aber häufig zu wünschen übrig. Mit einem einfachen Trick, den die Doktorandin Mira Pronobis von der University of North Carolina 2016 vorstellte, lässt sich die Ausbeute jedoch erheblich steigern (PLoS ONE, 11(8):e0160509; siehe auch Laborjournal 11/2016 „Molekulare Ringabzieher“). Bei Pronobis‘ „Miraprep“ mischt man die Proben unmittelbar vor Auftragen auf die Silica-Säulchen mit einem Volumen Ethanol. Die DNA wird hierdurch teilweise gefällt und bindet stärker an die Säule.

Der Miraprep hat aber einen Haken: Ethanol erhöht nicht nur die DNA-Ausbeute, sondern führt auch zu mehr störender RNA. Kommerzielle Kits enthalten im Resus­pensions- oder Neutrali­sierungspuffer RNAse A, deren Aktivität bei längerer Lagerung leidet. Beim Miraprep muss man das Enzym deshalb jeweils frisch zusetzen.

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Ohne RNAse, mit Isopropanol

Hu war das zu umständlich. Beim „Macerprep“ wird die RNA daher chemisch, durch alkalische Hydrolyse entfernt. Dazu erhitzt Hu die Zellen zehn Minuten im alkalischen Lysepuffer auf 95 °C und gibt anschließend die Neutrali­sierungslösung zu. Im Gegensatz zu Pronobis versetzt er die Proben vor dem Auftragen auf die Silica-Säulchen auch nicht mit Ethanol, sondern mit Isopropanol. Der chaotrope Effekt von Isopropanol verstärkt die Bindung der DNA an die Silica-Säulchen, wodurch kein zusätzliches Guanidinium­chlorid in der Neutrali­sierungslösung benötigt wird. Das ausführ­liche Protokoll des Macerpreps finden Sie in Hus bioRxiv-Manuskript (siehe unten).

Andrea Pitzschke

Hu I. (2020): The Macerprep: a minimalist kit- and enzyme-free high-yield miniprep utilising alkaline lysis and alkaline hydrolysis principles. BioRxiv, DOI: 10.1101/2020.08.13.249607

Bild: Pixabay/mcmurryjulie (bearbeitet)




Letzte Änderungen: 26.08.2020

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