An Standardprotokollen, die über Forschergenerationen hinweg in jedem Labor funktionieren, gibt es eigentlich nichts zu rütteln. Dennoch kann es sich lohnen, sich selbst ein so etabliertes Routineverfahren wie die Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien mit Miniprep-Kits nochmal genauer anzuschauen. Ian Hu, Algenforscher und Gründer des britischen Start-ups Phycobloom, störte insbesondere der hohe Preis kommerzieller Miniprep-Kits. Er entwickelte deshalb den „Macerprep“, der auf selbst hergestellten Puffern und Lösungen, Nullachtfünfzehn-Spinsäulen sowie der alkalischen RNA-Hydrolyse basiert.
Miniprep-Kits enthalten in der Regel eine Handvoll Pufferlösungen sowie kleine Silica-Spinsäulen. Die Zellen werden zunächst in Puffer 1 (P1) suspendiert und anschließend durch alkalische Hydrolyse in Lysepuffer (P2) aufgeschlossen. Danach wird das geklärte Lysat mit einer Guanidiniumchlorid-haltigen, sauren Neutralisierungslösung (N3) versetzt, die meist zusätzlich RNase A enthält. Das chaotrope Guanidiniumchlorid löst die Wasserstoffbrücken zwischen DNA und Wasser, wodurch die DNA-Moleküle gezwungen werden, an die Silica-Oberfläche zu binden. Anschließend entfernt man das Guanidiniumchlorid mit einem ethanolhaltigen Waschpuffer und eluiert die DNA schließlich mit einem wässrigen Puffer von der Säule.
Größere Ausbeute mit einfachem Trick
Mini-, Midi- oder Maxiprep-Kits liefern zwar im Handumdrehen saubere Plasmid-DNA, ihre Ausbeuten lassen aber häufig zu wünschen übrig. Mit einem einfachen Trick, den die Doktorandin Mira Pronobis von der University of North Carolina 2016 vorstellte, lässt sich die Ausbeute jedoch erheblich steigern (PLoS ONE, 11(8):e0160509; siehe auch Laborjournal 11/2016 „Molekulare Ringabzieher“). Bei Pronobis‘ „Miraprep“ mischt man die Proben unmittelbar vor Auftragen auf die Silica-Säulchen mit einem Volumen Ethanol. Die DNA wird hierdurch teilweise gefällt und bindet stärker an die Säule.
Der Miraprep hat aber einen Haken: Ethanol erhöht nicht nur die DNA-Ausbeute, sondern führt auch zu mehr störender RNA. Kommerzielle Kits enthalten im Resuspensions- oder Neutralisierungspuffer RNAse A, deren Aktivität bei längerer Lagerung leidet. Beim Miraprep muss man das Enzym deshalb jeweils frisch zusetzen.
Ohne RNAse, mit Isopropanol
Hu war das zu umständlich. Beim „Macerprep“ wird die RNA daher chemisch, durch alkalische Hydrolyse entfernt. Dazu erhitzt Hu die Zellen zehn Minuten im alkalischen Lysepuffer auf 95 °C und gibt anschließend die Neutralisierungslösung zu. Im Gegensatz zu Pronobis versetzt er die Proben vor dem Auftragen auf die Silica-Säulchen auch nicht mit Ethanol, sondern mit Isopropanol. Der chaotrope Effekt von Isopropanol verstärkt die Bindung der DNA an die Silica-Säulchen, wodurch kein zusätzliches Guanidiniumchlorid in der Neutralisierungslösung benötigt wird. Das ausführliche Protokoll des Macerpreps finden Sie in Hus bioRxiv-Manuskript (siehe unten).
Andrea Pitzschke
Hu I. (2020): The Macerprep: a minimalist kit- and enzyme-free high-yield miniprep utilising alkaline lysis and alkaline hydrolysis principles. BioRxiv, DOI: 10.1101/2020.08.13.249607
Bild: Pixabay/mcmurryjulie (bearbeitet)
