Einfach entfernt
(19.02.2020) Proben für die RNA-Sequenzierung sollten keine ribosomale RNA enthalten. Mit einem DIY-Kit lässt sich diese ganz einfach und kostengünstig dezimieren.
Bei der RNA-Sequenzierung sind gut vorbereitete Proben ohne störende ribosomale RNA (rRNA) obligatorisch. rRNAs machen meist achtzig Prozent oder mehr der Gesamt-RNA aus und sind für Genexpressions-Fragen irrelevant. Bakterien-mRNAs oder auch nicht-kodierenden RNAs fehlt jedoch der praktische polyA-Schwanz, mit dessen Hilfe man mRNAs leicht isolieren kann. Die Designer von rRNA-Depletions-Kits kamen deshalb auf die Idee, rRNAs mit biotinylierten Oligos und Streptavidin-Kügelchen aus den RNAseq-Proben herauszufischen. Die Kits sind aber nicht nur teuer. Es kann auch passieren, dass sie plötzlich nicht mehr angeboten werden, wie zum Beispiel aktuell der häufig verwendete Ribo-Zero-Kit von Illumina. Michael Laubs Gruppe am Massachusetts Institute of Technology in Cambridge, USA, hatte keine Lust mehr auf diese Unwägbarkeiten und stellte sich kurzerhand einen eigenen Do-it-Yourself-RNA-Depletions-Kit zusammen.
Biotinylieren und isolieren
Die Gruppe analysierte zunächst die rRNA-Sequenzen von Bakterien in silico und entwickelte hieraus einen Algorithmus für die Sequenz geeigneter Oligos, die mit diesen hybridisieren sollten. Der weitere Plan der Gruppe sah vor, die Oligos zu biotinylieren und die eingefangenen rRNAs schließlich mithilfe von Streptavidin-Kügelchen zu isolieren.
Die Gruppe konzentrierte sich zunächst auf die 23S-, 16S- und 5S-rRNAs von acht häufig im Labor eingesetzten Bakterienarten. Dabei achtete sie darauf, dass mehrere Oligos verschiedene Abschnitte der rRNAs abdeckten, um zu vermeiden, dass eine rRNA nur aufgrund ihrer Struktur nicht erkannt wird oder weil sie teilweise abgebaut ist. Mit Alignments von jeweils 23S-, 16S- sowie 5S-rRNA der acht Spezies spürten die Forscher möglichst konservierte Bereiche auf. Die nicht-konservierten Positionen in diesen Abschnitten belegten sie per Zufall mit einem Nukleotid.
Die Oligo-Sequenzen durchliefen dann einige Optimierungs-Runden am Computer. Sie wurden um ein paar Nukleotide verlängert beziehungsweise gekürzt oder an einzelnen Positionen mutiert. Das Ziel waren möglichst kurze, kostengünstige Oligos mit einer Schmelztemperatur von mindestens 62,5 °C. Nach fünfzehn bis zwanzig Zyklen hatte die Gruppe acht Oligos für die 16S-rRNA sowie neun für die 23S-rRNAs zusammen, die sich nicht überlappten.
Schwieriger bei 5S-rRNAs
Die Oligos waren dreißig Nukleotide lang und passten zumindest theoretisch für die rRNAs aller acht Spezies, auch wenn die Schmelztemperatur je nach Zielsequenz hie und da etwas vom Optimum abwich. Zusätzlich fanden die Forscher zwei Oligos, die selektiv mit 23S-rRNAs von Gramnegativen oder -positiven Bakterien hybridisierten. Für 5S-rRNAs war die Sache nicht so einfach, weil hier konservierte Motive fehlen. Laubs Team definierte für diese je zwei Spezies-spezifische Oligos.
Anschließend versah die Gruppe die Oligos mit einem 5‘-Biotin-Tag und inkubierte sie mit Gesamt-RNA der acht Bakterienspezies. Danach wurden die Proben mit Streptavidin-überzogenen Kügelchen gemischt, um die an den Oligos hängenden rRNAs abzutrennen. Jeweils vor und nach der Streptavidin-Trennung trug die Gruppe einen Teil der RNA-Probe auf ein Polyacrylamidgel auf und separierte sie elektrophoretisch. Auf den Gel-Banden war die selektive Abreicherung der spezifischen 16S-, 23S- beziehungsweise 5S-rRNA, deutlich zu sehen.
Um die Depletion der rRNA auch in Zahlen fassen zu können, sequenzierten Laubs Mitarbeiter die RNA von E. coli, B. subtilis sowie C. crescentus, jeweils vor und nach der rRNA-Depletion. Durch die Abreicherung sank der rRNA-Gehalt auf 13 %, 6 % beziehungsweise 22 %. Die Häufigkeit der Sequenzen, die von einem Oligo anvisiert wurden (Read Intensity), sank relativ einheitlich. Alle Oligos hybridisierten demnach in etwa gleich gut mit ihren rRNA-Zielen. Off-target-Effekte traten kaum auf.
Vergleich mit kommerziellem Kit
Wie gut sich der DIY-rRNA-Depletion-Kit gegenüber einem kommerziellen Kit schlagen würde, untersuchte die Gruppe mit der RNA-Sequenzierung von E.-coli-Zellen, die fünf Minuten mit Rifampicin oder Chloramphenicol behandelt worden waren. Sämtliche Schritte für die Herstellung der Sequenzier-Bibliothek (Fragmentierung, cDNA-Synthese, Adapter-Ligation, Amplifikation) waren identisch. Der einzige Unterschied war die rRNA-Abreicherung unmittelbar nach der RNA-Isolierung, die mit dem DIY-rRNA-Depletion-Kit oder dem Ribo-Zero-Kit durchgeführt wurde.
Mit beiden rRNA-Depletions-Methoden maß die Gruppe ähnliche Änderungen der Expression, die durch die Antibiotika induziert wurden. Der DIY-Kit steht also kommerziellen Kits in nichts nach, kostet aber nur einen Bruchteil (der einzige Kostenfaktor sind die Streptavidin-Beads). Wer zusätzliche Oligos für spezielle Spezies benötigt, kann diese auch mithilfe von Laubs frei verfügbarer Oligo-Software selbst maßschneidern.
Andrea Pitzschke
Culviner P. et al. (2020): A simple, cost-effective, and robust method for rRNA depletion in RNA-sequencing studies. BioRxiv, DOI: 10.1101/2020.01.06.896837
Foto: PennState Huck Institutes of the Life Sciences
