Cannabinoide aus dem Reagenzglas

Prenylierung ist eine kovalente Modifikation, die in Proteinen (am Cystein-Rest, zur Membran-Veran­kerung) aber auch anderen Zellsub­straten auftritt. Ein Terpenrest, der ursprünglich in Form einer Pyro­phosphat-Verbin­dung vorliegt, wird auf das Zielsubstrat übertragen. Prenyl­transfe­rasen setzen so zum Beispiel Flavonoide und Geranyl­pyrophos­phat zu Geranyl-Flavonoiden und Pyro­phosphat um. Viele natürlich vorkom­menden Prenyl­verbin­dungen sind potenziell „bioaktive Moleküle“ mit medizi­nischer Wirkung. Ihre heißesten Vertreter sind Canna­binoide.

Vor gut zwei Jahren wurde in Deutschland die Verwendung von Canna­bis(extrakten) legalisiert – wenn auch vorerst nur nach ärztlicher Verschreibung. Logische Folge: Der Bedarf wächst, und er wird mit importiertem „Gras“ kaum mehr zu decken sein. Anwendungs­orientierte Forscher und Firmen synthetisieren Canna­binoide mithilfe genetisch manipulierter Algen oder Mikro­organismen. Prinzipiell funktioniert das. Die lebenden Fabriken produzieren neben den gewünschten Substanzen aber noch viele andere. Die Spreu vom Weizen, beziehungs­weise die Canna­binoide von uner­wünschten Produkten zu trennen, ist aufwendig. Hinzu kommt, dass die Canna­binoid-Vorstufe Gerany­lpyro­phosphat (GPP) ab einer bestimmten Dosis toxisch wirkt und hierdurch die Ausbeute limitiert ist.

Lieber synthetisch und zellfrei

Statt sich mit schlecht funktionierenden Expressions-Systemen abzumühen, setzen Forscher der University of California, Los Angeles, und der University of Washington um den kalifor­nischen Biochemiker James Bowie bei der Produktion prenylierter Naturstoffe auf synthe­tische Biochemie und ein zellfreies Produktions­system.

Das Team fand einen originellen Weg, mit billigem Trauben­zucker an die kritische und teure Vorstufe Geranyl­pyro­phosphat, zu gelangen, indem es Stoffwechsel­wege künstlich zusammen­baute und veränderte. Die hierfür verwendeten Zutaten sind boden­ständig: Stabile thermo­phile Enzyme, klassisch produziert im E. coli-Stamm BL21, mit pET28 als Expressions­vektor; IPTG zur Induktion; und Nickel-Säulchen zur Aufreini­gung der His-getaggten Proteine.

Der Prozess umfasst drei Module und ein Dutzend Enzyme. Ausgehend von Glucose spielt das erste Modul quasi die Glycolyse nach und erzeugt über neun enzyma­tische Umwand­lungen Pyruvat sowie ATP und NADPH. Pyruvat wird dann mittels Pyruvat­dehydro­genase (PDH) zu AcetylCoA umgesetzt und liefert so den Ausgangs­stoff für Enzyme des Mevalonat­wegs. Unter Verbrauch von NADPH und ATP entsteht sukzessive Dimethyl­allylpyro­phosphat (DMAPP) und GPP. Hat man diese aktivierten Prenyl­verbin­dungen erst einmal in der Hand, ist es bis zum fertigen Wunsch­produkt nicht mehr weit. Nach Zugabe der zu prenylie­renden Verbindung vollziehen die wenig selektiven aroma­tischen Prenyl­transfe­rasen (aPT) den Transfer zum fertigen Prenyl- sowie Geranyl-Flavonoid oder Prenyl (geranyl)-Stilben.

Mutiertes Super-Enzym

Für die Prenylierung der Cannabinoid-Vorstufen Olivetolsäure (OA) und Divarinsäure zu Cannabi­gerolsäure (CBGA) sowie Cannabi­gerovarin­säure (CBGVA) ist die Prenyl­transferase NphB zuständig, die jedoch ziemlich unspezifisch und langsam ist. Um sie etwas auf Vordermann zu bringen, nahm das Forscher­team die Bindung von Nphb an Olivetol­säure als Ausgangs­punkt für die Suche nach Varianten mit erhöhter Aktivität. Mithilfe des Struktur­vorhersage-Programms „Rosetta“ stieß die Gruppe auf Mutationen an zwei Aminosäure-Positionen, die zu einer tausend­fachen Erhöhung der Enzym­aktivität in der expri­mierten dNphB-Variante führten. Das Super-Enzym ist im Wässrigen löslich und somit für zellfreie Systeme wesentlich besser geeignet als das natürliche Pendant aus Cannabis (membran­ständige Prenyl­transferase).

Mit ein paar zusätzliche Optimierungen steigerte die Gruppe die CBGA-Ausbeute weiter:
- Die Entstehung und der Verbrauch von Reduktions­äquiva­lenten (NADPH) und ATP wurden so an angepasst, dass das System über mehrere Tage autonom arbeitet (Nat Commun. 5:4113; Nat Chem Biol, 13:938-42).

- Weil das zur AcCoA nötige Enzym PDH mitunter empfindlich auf Prenylierungs-Substrate reagiert und die Forscher eine generell funktio­nierende Preny­lierungs-Strategie schaffen wollten, legten sie einen Bypass. Der konven­tionelle Weg von Pyruvat zu AcetylCoA mittels PDH wird abgelöst durch ein Enzym-Duo aus Pyruvat­oxidase und Acetyl-Phosphat-Transferase. Nützlicher Neben­effekt: die beiden sind wesentlich kleiner als PDH und dement­sprechend einfacher rekombinant herzustellen.

- So hochaktiv die optimierte dNphB auch ist, in puncto Kondition kann sie mit dem Wildtyp-Enzym nicht mithalten. Nach 24 Stunden ging ihr die Luft aus. Produktions­stillstand. Mehr als 500 mg/l CBGA brachte sie nicht zustande. Ein Blick auf das getrübte Reaktions­gemisch lieferte die Antwort. Offenbar flockt die Prenyl­transferase ab einer bestimmten CBGA-Konzentration aus. Auch für dieses Problem fand das Team eine pfiffige Lösung: Es über­schichtete das Reaktions­gemisch mit einer Nonan-Lösung.

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Fischen mit Pumpe

Leider verbleibt CBGA viel lieber im wässrigen Milieu und wandert nur spuren­weise in die organische Phase. Dennoch lässt es sich „heraus­fischen“, und zwar mithilfe einer Peristaltik­pumpe und einem separaten Auffang­gefäß. Letzteres enthält eine Tris-Lösung („CBGA capture“: 50 mM Tris pH 8,5), ebenfalls überlagert mit einer Nonan-Lösung. Reaktions- und Auffang­gefäß sowie die Pumpe schaltet man in einem Kreis. Die Pumpe zirkuliert die Nonan-Phasen zwischen beiden Gefäßen. Sie saugt kontinuierlich die Nonan-Phase aus dem Auffang­gefäß ab und tropft sie ins Reaktions­gefäß. Von dort wird sie, zusammen mit kleinen darin enthaltenen Mengen CBGA, in die wässrige Phase des Auffang­gefäßes geleitet. Während sich organische und wässrige Phase wieder trennen, bleiben die mitge­schleppten CBGA-Moleküle in der wässrigen Phase hängen. Der Trick mit Pumpe und Über­schichtung könnte für so manch anderes Molekül mit gespal­tener Lipophilie-Persön­lichkeit nützlich sein.

Um schließlich das heißbegehrte Endprodukt Cannabi­diolsäure (CBDA) zu erhalten, gibt man die CBGA-haltige Nonan-Phase auf ein wässriges Reaktions­gemisch mit Cannabi­diolsäure-Synthase. Natürliche Cannabis­freunde wissen aber: die Carboxy­lierungs­reaktion lässt sich auch einfach durch Erhitzung bewerk­stelligen.

Alle Optimierungen zusammengenommen konnten Bowies Mitarbeiter die CBGA-Produktion verglichen mit der Ausgangs­situation um den Faktor 140 herauf­fahren. Ob der letztendlich erreichte Titer von 1,25 g/l schon gut genug ist für den kommer­ziellen Einstieg und ob das Ganze auch im größeren Maßstab funktioniert, muss sich zeigen.

Andrea Pitzschke

Valliere M. et al. (2019): A cell-free platform for the prenylation of natural products and application to cannabinoid production. Nature Communications, 10:565