(3. Januar 2012) Gekaufte Antikörper können ein Segen sein, vor allem, wenn die Experimente damit wunderbar laufen. Und wenn es nicht klappt, ist schnell ein Schuldiger gefunden: der gekaufte Antikörper! Laborjournal sprach mit dem Biochemiker Oliver Theunissen vom technischen Service der Hamburger Antikörper-Firma Biomol über Probleme mit Antikörpern und die Versprechen der Hersteller.
Laborjournal: Wozu braucht man Antikörper in der Forschung und im Labor?
Oliver Theunissen: Man braucht Antikörper um Proteine zu erkennen. So wie man Nukleotide durch komplementäre Oligonukleotide detektieren kann, braucht man auch ein Komplement für Proteine. In der Praxis hat sich herausgestellt, dass Antikörper dafür die beste Wahl sind. Man kann theoretisch auch über Phagen-Display Proteine oder Peptide selektieren und an Proteine binden, aber im Laufe von einigen hundert Millionen Jahren Evolution haben die Tiere dieses System so weit perfektioniert, dass sie einfach besser sind, als der Mensch im Labor. Auch wenn Antikörper aus Sicht der Evolution eher dafür gedacht sind Pathogene zu erkennen. Im Labor kann man beliebige chemische Strukturen an sogenannte immunogene Proteine koppeln und damit ein Tier immunisieren, worauf eine Reihe von Antikörpern gebildet wird, meist gegen das Protein, aber einige auch gegen die an das Protein gekoppelte chemische Struktur.
Welche Probleme hat man typischerweise, wenn man mit Antikörpern arbeitet?
Oliver Theunissen: Dass nicht das raus kommt, was man erwartet! Es hängt auch immer von den Methoden ab. Die wichtigsten sind Western-Blot, Färbungen an Zellen und Geweben, die Detektion in Lösung – meist ein ELISA – oder an der Oberfläche von Zellen, die man mit FACS sortieren will. Allen Methoden sind zwei Probleme gemein. Erstens: Das Antigen wird nicht erkannt und es gibt kein Signal. Zweitens: Es wird mehr als nur das Antigen erkannt und man erhält eine allgemein unspezifische Färbung. Da es eigentlich immer eine Protein-Protein-Wechselwirkung ist, können verschiedene Faktoren darauf Einfluss nehmen. Man muss zum Beispiel meistens zusätzliche Proteine während der Antigen-Antikörper-Reaktion dabei haben, um unspezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu inhibieren. Beim Western-Blot macht man das, in dem man Milchproteine, BSA oder ein unspezifisches Serum dazu gibt. Es gibt viele Möglichkeiten und Detergenzien die Affinität hoch und runter zu schrauben. Meistens gibt es einen schmalen Bereich in dem man das Optimum an Signalstärke und -schwäche des Background-Signals hat.
Was steht alles im Datenblatt und was verspricht der Hersteller damit?
Oliver Theunissen: Es ist recht unterschiedlich, was in den Datenblättern verschiedener Firmen steht. Meistens in welcher Anwendung ein Antikörper funktioniert und in welcher Verdünnung man ihn dafür einsetzen sollte, zumindest als Startwert. Es steht drin mit welchen Methoden der Antikörper aufgereinigt wurde und aus welcher Tierart er stammt. Die meisten Antikörper-herstellenden Firmen sprechen mehr oder weniger eine Garantie dafür aus, dass das was im Datenblatt steht, auch tatsächlich funktioniert. Wenn da steht „funktioniert im Western-Blot“, dann ist damit – meint man – auch die Garantie verbunden, dass es im Western-Blot funktioniert. Nur sind die Experimente häufig nicht so einfach strukturiert, wie die im Datenblatt, wo man eine Positivkontrolle nimmt, Antikörper dazu gibt und ein Signal erhält. Deshalb kommt es in der Praxis immer wieder vor, dass der Antikörper nicht das gewünschte Ergebnis liefert. Nichts desto trotz, kann es auch mal sein, dass das Protein vielleicht gar nicht da ist und man es deswegen nicht sieht. Beim phospho-spezifischen Antikörper beispielsweise muss auch eine Phosphorylierung vorhanden sein, damit sie detektiert werden kann. Bloß, weil man Geld für etwas zahlt, heißt es noch nicht, dass man damit garantiert eine Veröffentlichung in einem Journal hinkriegt. Man spart sich einfach die Antikörper selber zu machen und diese Zeitersparnis kostet Geld.
Warum sind bei kommerziellen Antikörpern die Epitope nicht automatisch definiert?
Oliver Theunissen: Unter gewissen Umständen ist man sehr daran interessiert zu wissen, welcher Bereich eines Moleküls – welches Epitop – von einem monoklonalen Antikörper erkannt wird. Bei polyklonalen Antikörpern dagegen kann man eigentlich immer davon ausgehen, dass sie sämtliche Bereiche eines Proteins erkennen. Gerade bei monoklonalen Antikörpern aus der Maus ist es aber so, dass man Mäuse eigentlich ausschließlich mit großen Proteinfragmenten oder sogar Zellpräparationen effektiv immunisieren kann. Die Maus macht Antikörper gegen alles, was sie auf dieser Oberfläche – diesem Immunogen – findet und der Antikörper-Produzent selektiert Klone, die detektieren, was er will. Bis man schließlich vielleicht einen Antikörper findet, der beispielsweise genau CD4 als Oberflächenmarker erkennt, sind hunderte von Messungen nötig. Wenn das der Fall ist, geben sich die meisten schon zufrieden. Um ein Epitop zu bestimmen, muss man das Antigen immer weiter verkleinern, bis man schließlich herausfindet, was noch erkannt wird und was nicht. Oft ist es schwierig das Epitop genau zu bestimmen, weil es dreidimensional ist, was sich aus der Sequenz und der Faltung des Proteins ergibt. Wenn dagegen ein linearer Abschnitt auf der Primärstruktur des Proteins erkannt wird, ist es relativ einfach. Weil es für viele gar nicht so eine große Rolle spielt, verzichten die meisten Firmen darauf. In früheren Zeiten hatte man auch gar nicht die Möglichkeiten. Gerade gegen viele Oberflächenmoleküle gab es schon sehr gute Antikörper, die überall in der Diagnose eingesetzt wurden, ohne, dass man jemals wusste, welches Protein eigentlich dahinter steckte. Man wusste einfach nur, welche Zellen damit erkannt werden.
Kann man Antikörper auch gegen genau ein Epitop machen?
Oliver Theunissen: Ein anderer Weg ist, dass man den Antikörper gegen ein Peptid von bekannter Sequenz macht, die erfahrungsgemäß gut immunogen ist, die also Aminosäuren enthält gegen die gut Antikörper gemacht werden können, und zudem spezifisch für dieses Protein ist, das heißt in keinem anderen Protein im selben Organismus vorkommt. Das geht aber nicht mit Mäusen, weil die Mäuse aufgrund der Präsentation der Peptide auf den MHC-haltigen Zellen solche Peptide einfach nicht präsentieren. Deshalb muss man auf Kaninchen umsteigen. Dann kann man sagen, dass der Antikörper den Bereich des Proteins erkennt, wo das immunogene Peptid liegt. Allerdings sind die meisten Antikörper aus dem Kaninchen keine monoklonalen Antikörper, sondern polyklonale Antikörper. Und nur bei monoklonalen Kaninchen-Antikörpern kann man auch, ohne dass man eine aufwendige Epitop-Bestimmung machen muss, wirklich sagen, dass es ein Epitop ist und wo es liegt.
Lange gab es keine monoklonalen Kaninchen-Antikörper, warum?
Oliver Theunissen: Man muss bei monoklonalen Antikörpern sogenannte Hybridoma machen. Das heißt, man nimmt aus der Milz des Tieres die Antikörper-produzierenden Zellen und verschmilzt sie mit Zellen, die sich in Zellkultur dauerhaft teilen können. Dann selektiert man Hybridoma-Zellen, die einen brauchbaren Antikörper produzieren. Wenn aber dieses Hybridoma nach ein, zwei Monaten den Bach runter geht, kann man darauf keine stabile Antikörper-Produktion aufbauen. Und genau das ist – aus welchen Gründen auch immer – bei Kaninchen-Antikörpern im Allgemeinen der Fall. Erst mit einem Patent der Firma Epitomics ist es gelungen stabile Hybridoma zu produzieren und sicherzustellen, dass ein monoklonaler Antikörper immer wieder hergestellt werden kann. Man erwartet von einem monoklonalen Antikörper ja eigentlich, dass man nicht nur eine Minicharge macht, sondern ihn in beliebiger Menge produziert. Wenn dagegen der polyklonale Antikörper aufgebraucht und das Kaninchen gestorben ist, muss man ganz von vorne Anfangen. Dann hat man vielleicht ein Kaninchen, das aufgrund anderer Nahrung, anderer Umweltumstände und anderer genetischer Ausstattung einen anderen Antikörper macht. Deswegen bevorzugen viele Wissenschaftler, die über Jahre hinweg gleichbleibende Qualität erwarten, monoklonale Antikörper.
An was sollten Forscher bei der Arbeit mit Antikörpern noch denken?
Oliver Theunissen: Man sollte immer daran denken, dass keine der Mäuse und keines der Kaninchen sein Leben freiwillig hergibt. Das ist allein im Interesse des Wissenschaftlers. Einen gewissen Respekt haben die Tiere da schon verdient.
Interview: Valérie Labonté
Bild: privat