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Porentiefe Strukturaufklärung in heißen Pilzen

Heidelberger Wissenschaftler rekonstruierten das Grundgerüst der Kernpore in vitro und etablierten nebenbei einen neuen eukaryotischen Modellorganismus.

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(16. August 2011) Die Strukturaufklärung der Kernpore, die den Stofftransport zwischen Nukleus und Cytoplasma vermittelt, steht schon lange auf der Wunschliste vieler Biochemiker. Besonders wenig wusste man bisher über den inneren Ring der Pore, der das Grundgerüst dieses wahrscheinlich größten makromolekularen Komplexes in der eukaryotischen Zelle darstellt. Eine Heidelberger Kooperation zwischen den Laboren von Ed Hurt vom Biochemie-Zentrum der Uni (BZH) und Peer Bork vom Europäischen Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL), bildete nun erstmalig den inneren Ring der Kernpore in vitro nach und klärte Proteininteraktionen zwischen den einzelnen Bausteinen auf (Amlacher et al., Cell 2011, 146:277-89). Hierfür kam ein neuer Modellorganismus zum Einsatz, der thermophile Pilz Chaetomium thermophilum.

 

Die Kernpore ist aus etwa 30 verschiedenen Proteinen, den Nukleoporinen (Nups), aufgebaut. Diese liegen in mehreren Kopien vor und bilden evolutionär hoch konservierte Subkomplexe, aus denen sich die gesamte Kernpore zusammensetzt. Mit Hefe, dem Standardmodell eukaryotischer Zellen, funktionierte eine in vitro-Rekonstitution der Subkomplexe nicht. Hefe-Nups oder rekombinante Nups, die in E. coli hergestellt wurden, konnten nicht in ausreichender Menge isoliert und gereinigt werden. Außerdem waren die Proteine relativ instabil und bildeten in vitro nur schwache Wechselwirkungen aus.

Eine Lösung des Problems hatte Ed Hurt, der Leiter der Forschungsgruppe „Gene Expression and Nuclear Export“, schon längere Zeit im Sinn. Von Prokaryoten wusste man, dass die Proteine thermophiler Bakterien außerhalb der Zelle stabiler sind als die ihrer mesophilen Verwandten. Um die Kernpore zu untersuchen, musste also ein thermophiler Eukaryot als Modell her. Der Pilz C. thermophilum, der normalerweise von verrottendem Pflanzenmaterial lebt und im Komposthaufen Temperaturen von bis zu 60 °C erträgt, schien gut für eine Kultivierung im Labor geeignet zu sein. Die Einführung dieses neuen Modells übernahm Stefan Amlacher, Doktorand im Hurt-Labor, der zusammen mit Phillip Sarges, Dirk Flemming und Vera van Noort Erstautor der Studie ist. Dazu Amlacher: „Saccharomyces cerevisiae ist zwar das Standardmodell eukaryotischer Zellen, weist aber viele genetische Eigenheiten auf und ist vom humanen System relativ weit entfernt. Die Nukleoporine unseres Pilzes ähneln dagegen denen höherer Eukaryoten.“

Um stabile Nups für Strukturanalysen zu erhalten, identifizierten die Forscher zunächst die Nup-Gene des Pilzes. Dabei sequenzierten sie gleich das gesamte Pilz-Genom. Die Bioinformatiker um Peer Bork ordneten die Sequenzinformation und annotierten mehr als 7.000 proteinkodierende Gene. Damit publizierten die Heidelberger erstmalig die Genomsequenz eines thermophilen eukaryotischen Organismus.

Über Sequenzvergleiche mit anderen Organismen fanden sich diejenigen Gene, die für die gesuchten 30 Pilz-Nups kodieren. Diese klonierten die Forscher und exprimierten sie in Hefe. Tatsächlich konnten sie stabile Pilz-Nups in ausreichender Menge isolieren und reinigen, was die Untersuchung spezifischer Interaktionen mittels in vitro-Bindungsassays ermöglichte. Die Forscher begannen mit paarweisen Interaktionen und rekonstruierten schließlich den tetrameren Komplex des inneren Porenrings. „Damit konnten wir endlich den Komplex aufbauen, über den schon lange diskutiert worden ist“, so Amlacher. Dabei zeigten die Forscher eine neue Form der Nub-Interaktion. Sie vermuten, dass die Vernetzung der großen Nups über kleinere Linker-Nups dem zentralen Transportkanal der Kernpore eine gewisse Flexibilität verleihen könnte, so dass sich dieser an die zu transportierenden Moleküle anpassen kann. Ein weiterer Erfolg war die Strukturanalyse der Nups im Elektronenmikroskop. „Unsere Daten liefern die erste Strukturinformation zu diesen Molekülen überhaupt. So konnten wir die halbmondförmige beziehungsweise S-förmige Struktur von Nup170 und Nup192 zeigen und 3D-Volumen berechnen“, erklärt Amlacher.

Die Stabilität der Nups aus C. thermophilum erleichtert in Zukunft die Aufklärung der bisher nur unzureichend bekannten Kristallstrukturen. „Viele Gruppen arbeiten schon seit 10 bis 15 Jahren daran doch bisher hat man erst 23 Prozent der Gesamtmasse der Kernpore kristallisieren können. Die Kristallisation der Pilz-Nups ist unser nächstes großes Ziel“, so Amlacher. Der Doktorand betont die Wichtigkeit des neuen Modells: „Wir haben mit der Etablierung dieses thermophilen Pilzes eine Ressource geschaffen, die sich hervorragend als Modell für die Strukturanalyse großer eukaryotischer Proteinkomplexe eignet“.


Kai Krämer
Bild: istock/Excitator



Letzte Änderungen: 04.03.2013

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