Wer sich zum Frühstück ein Spiegelei in die Pfanne haut, macht immer auch eine Schmelzkurven-Analyse von Proteinen. Je länger ein Protein der Hitze standhält, desto stabiler ist es. Bei Medikamenten-Screenings macht man sich dieses simple Gesetz zunutze, um mit Temperatur-Shift-Assays beziehungsweise der Differential Scanning Fluorimetry (DSF) zu beobachten, ob und um wie viel Grad Celsius ein potenziell stabilisierender Ligand die Schmelztemperatur eines Proteins verändert.
DSF-Experimente werden meist in qPCR-Cyclern oder speziellen DSF-Instrumenten durchgeführt. Die Probe wird dazu mit dem Farbstoff SYPRO Orange versetzt, der in Gegenwart des nativen Proteins nur gering fluoresziert. Entfalten sich jedoch durch die erhöhte Temperatur hydrophobe Abschnitte aus dem Inneren des Proteins, binden diese an den Farbstoff, wodurch sich die Fluoreszenz stark erhöht.
Nicht optimal
Sowohl qPCR-Cycler als auch DSF-Geräte sind teuer und nicht ganz perfekt für Schmelzkurven-Analysen geeignet. In qPCR-Cyclern lässt sich zum Beispiel die Temperatur sehr exakt einstellen, die optischen Filter passen aber nicht optimal zum Spektrum von SYPRO Orange. Fluoreszenz-Spektrometer kann man dagegen sehr präzise auf eine gewünschte Wellenlänge einstellen, dafür hapert es bei der Temperatur an der nötigen Genauigkeit.
Tanja Schirmeisters Gruppe an der Johannes Gutenberg-Universität in Mainz hat sich deshalb kurzerhand ein eigenes DSF-Instrument (openDSF) ausgedacht, das mit allem Drum und Dran gerade mal 176 Euro kostet. Federführend bei Entwicklung, Bau und Programmierung war Doktorand Fabian Barthels, der das Gerät auch validiert hat. Die Komponenten für das Gehäuse stellten die Beteiligten mit dem 3D-Drucker her, die Teile für das Innenleben stammen vom Elektronik-Fachhandel.
Das openDSF hat die Form eines Joysticks und besteht aus Gehäuse, Microcontroller, Heizsystem, Temperatursensoren sowie Fluoreszenzmodul. Die insgesamt vierzehn 3D-gedruckten Teile sind aus hitzebeständigem Polyoxymethylen (formstabil bis 130°C) gefertigt und doppelwandig aufgebaut, um die Isolierung zu erhöhen. Ein schwarzer Lacküberzug stabilisiert die Probenhalterung und schluckt zudem Streulicht.
Filter mit Bühnenerfahrung
Der Aufbau des selbstgebauten DSF-Instruments ist klar strukturiert. An der Basis ist ein kleiner Ventilator angebracht, der Luft ansaugt und über eine Heizspirale in einer Röhre bläst. Am oberen Ende geht die Röhre in die Probenhalterung über, die Platz für vier PCR-Gefäße bietet, in denen die Proben untergebracht sind. Jede Probenposition wird von einer königsblauen LED bestrahlt, eine rechtwinklig dazu angebrachte Photodiode registriert die emittierte Fluoreszenz. Bevor Licht auf die Probe trifft oder diese verlässt, muss es eine dünne orangefarbene Folie passieren. Dieser simple Filter, den Schirmeisters Team von Bühnenbeleuchtungen abgekupfert hat, verhindert, dass unspezifische Anregungsstrahlen, etwa aus den benachbarten Probengefäßen, auf die Probe treffen. Da die Transmissionsrate der Folie über 80 Prozent beträgt, geht dennoch nur ein Bruchteil des emittierten Lichts verloren.
Die Temperatur in den vier Proben wird mit sogenannten Thermistoren gemessen, die von oben in die Probengefäße ragen und diese zugleich verschießen. Ihr Messbereich liegt zwischen 20 und 95 Grad Celsius. Die einzelnen Module sind mit einem Microcontroller verdrahtet, der an einen PC angeschlossen ist. Der Microcontroller steuert LEDs, Ventilator und Heizdraht. Heizdraht und Miniventilator sind so konzipiert, dass die Proben mit Heizraten von 0,1 bis 9 Grad Celsius pro Minute aufgeheizt werden können.
Zuverlässige Messungen
Hat man die Komponenten zusammengebaut, kann die Analyse losgehen. Hierfür werden gleiche Teile der Proteinlösung (10µM) und SYPRO Orange (10-fach Konzentrat, versetzt mit 10% DMSO) gemischt und kurz zentrifugiert. 30 Mikroliter der Partikel-freien Mischung werden in ein Probengefäß überführt, das in den Probenhalter gesteckt wird. Anschließend setzt man den Thermistor auf den Probehalter und startet die Messung mit dem Computer, der die einzelnen Befehle an den Microcontroller weiterleitet. Die Belichtung mit der LED sollte möglichst kurz dauern, 50 Millisekunden reichen aus – wer länger bestrahlt, riskiert, dass der Farbstoff ausbleicht.
Dass die Messungen mit dem openDSF aus Mainz zuverlässig sind, zeigt die Gruppe anhand von acht Proteinen mit bekannter Schmelztemperatur (u. a. BSA, Lysozym, Calpain I). Nur im Fall von Thrombin lagen die Messwerte leicht daneben (52°C statt 58°C). Auch die gemessenen Schmelzpunkte von RNA-Aptameren entsprachen ziemlich genau den Werten aus qPCR-Cyclern. Statt mit SYPRO Orange werden Nukleinsäure-Proben mit dem interkalierenden Farbstoff SybrGold versetzt. Das Messprinzip ist aber das gleiche.
Andrea Pitzschke
Barthels F. et al. (2022): A low-cost 3D-printable differential scanning fluorometer for protein and RNA melting experiments. HardwareX, 11:e00256
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