Hinter genetisch bedingten Krankheiten stecken vor allem Punktmutationen. Soll die mutierte Base mithilfe einer Gentherapie ausgetauscht werden, muss die Korrektur punktgenau erfolgen und darf den Rest des Genoms nicht in Mitleidenschaft ziehen. Eine Grundvoraussetzung hierfür ist, dass die für die Korrektur eingesetzten Basen-Editoren die betroffenen Zellen auch erreichen.
Für den Transport der Basen-Editoren werden meist Vektoren auf Basis von Adeno-assoziierten Viren (AAV) eingesetzt, was sich auch in den Datenbanken der US Food and Drug Administration (FDA) sowie der European Union Drug Regulating Authorities Clinical Trials Database (EudraCT) widerspiegelt. Anfang letzten Jahres führten diese 149 klinische Studien auf, in denen AAV-basierte Gentherapien getestet wurden (Nat Rev Drug Discov, 20(3):173-174).
Abgespecktes Konstrukt
Die Ladekapazität Adeno-assoziierter Viren ist aber auf fünf Kilobasenpaare (kb) beschränkt – das reicht nicht für die 5,2 kb lange codierende Sequenz der Nuklease Cas9 aus Streptococcus pyogenes (SpyCas9), die häufig in Konstrukten von Basen-Editoren eingesetzt wird. Cas9 wird deshalb meist in zwei Teile aufgeteilt und in zwei getrennte AAV-Vektoren verpackt. Mit diesem Dual-AAV-Delivery-Ansatz geht aber auch eine höhere Dosierung und damit ein höheres Risiko für Nebenwirkungen einher. Erik J. Sontheimers Gruppe von der University of Massachusetts Medical School speckte deshalb das Genkonstrukt für den Basen-Editor so weit ab, dass es in einen AAV-Vektor passt.
Basen-Editoren bestehen aus einer Desaminase, die mit einer inaktiven Cas9 fusioniert ist, sowie einer sgRNA, die wie ein Rucksack an Cas9 hängt. Adenin-Basen-Editoren (ABE) wandeln A-T-Paarungen zu G-C-Paarungen um, Cytidin-Basen-Editoren (CBE) C-G zu T-A. Wie beim Gene Editing mit CRISPR-Cas9 leitet die sgRNA die Fusion aus Cas9 und der Desaminase zur Zielsequenz, die ein Protospacer Adjacent Motif (PAM) enthalten muss.
Neisseria statt Streptococcus
Statt der sperrigen SpyCas9 nutzt die Gruppe in ihrem Basen-Editor die kompaktere Cas9-Nuklease aus Neisseria meningitidis (Nme2Cas9), die zudem ein eher unkonventionelles PAM-Erkennungsmotiv (N4CC) aufweist. Das Team fusionierte zunächst eine optimierte TadA-Desaminase (TadA8e) aus dem dualen SpyCas9-System (Spy-ABE8e) N-terminal an Nme2Cas9. Die Funktion dieses Adenin-Basen-Editors (Nme2-ABE8e) testeten die Forscher in einer ABE-Reporter-Zelllinie, die ein defektes mCherry-Gen mit einer G-zu-A-Mutation enthielt. Die Zellen konnten nur fluoreszieren, wenn Nme2-ABE8e die Mutation wieder rückgängig machte, was auch tatsächlich der Fall war. Systematische Tests mit sgRNAs, die Fehlpaarungen trugen, zeigten zudem, dass Nme2-ABE8e weniger Off-Target-Effekte produzierte als Spy-ABE8e.
Danach ging es daran, Nme2-ABE8e zu optimieren. Um die Transfektionseffizienz zu verbessern, stattete die Gruppe Nme2-ABE8e zunächst mit einem effektiven Kernlokalisierungssignal (NLS) aus. Danach suchte sie nach einem möglichst schlanken Promotor für die sgRNA und fand schließlich einen 249 Basenpaare langen sogenannten U6-Promotor, der von Säugerzellen erkannt wird. Das endgültige, für den optimierten Nme2-ABE8e-Editor codierende Genkonstrukt ist 4.998 Basenpaare lang und passt damit gerade noch in einen AAV-Vektor.
Nme2-ABE8e bestand erfolgreich einen In-vivo-Test, bei dem der Basen-Editor in einem Mausmodell einen Gendefekt in der Leber rückgängig machen musste. Das außergewöhnliche PAM-Erkennungsmotiv von Nme2Cas9 verschafft zudem Zutritt zu Gendefekten, bei denen die SpyCas9 kapitulieren muss.
Andrea Pitzschke
Zhang H. et al. (2022): Adenine base editing in vivo with a single adeno-associated virus vector. BioRxiv, DOI: 10.1101/2021.12.13.472434
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