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PCR mit Blättern
auf Papier

(08.12.2021) Warum umständlich DNA aus Blättern isolieren, wenn man sie auch direkt für die PCR einsetzen kann? Einfach auf Filterpapier fixieren und trocknen.
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Die Gewinnung von Pflanzen-DNA, etwa für großangelegte Genotypi­sierungen mithilfe einer PCR, führt meist über Gewebe­aufschluss, DNA-Extraktion und Reinigung der DNA. Da in Pflanzen­geweben viele potenzielle PCR-Inhibitoren lauern, ist die DNA-Isolation sehr mühselig und mit den häufig dazu verwendeten kommerziellen Kits auch ziemlich teuer. Zudem müssen Pflanzen­material und isolierte DNA ordentlich gelagert werden, um ihren Abbau zu verhindern. Die hierfür angebotenen Karten aus einer speziellen Fasermatrix reißen jedoch ziemlich große Löcher in den Laboretat – insbesondere wenn im Hochdurchsatz sehr viele Proben eingelagert werden müssen.

Kenichi Tsudas Gruppe von der Huazhong Agricultural University in Wuhan, China, sah sich nach einer günstigen Alternative für die Lagerkarten um, und stieß dabei auf stink­normales Filterpapier aus Zellulose. Das Papier ist aber nicht nur zur Konservierung von Pflanzen­proben geeignet: Das darauf gelagerte Pflanzen­gewebe kann ohne zusätzliche DNA-Extraktion in einer PCR eingesetzt werden.

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Schwenken, Fischen, Trocknen

Für die Herstellung der Lagerkarten aus Filterpapier bedeckt man einen Rundfilter in einer Petrischale mit dreißig Milliliter Puffer (20 % SDS, 60 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7,5), schwenkt die verschlossene Schale eine Stunde, fischt das Papier danach mit einer Pinzette heraus und trocknet es schließlich an der Luft.

Die einzelnen Blätter legt man danach mit etwas Abstand zueinander auf das vorbehandelte Filterpapier und deckt sie mit einem Parafilm ab. Anschließend zerquetscht man sie zwischen Filter und Folie, indem man die Unterseite eines senkrecht gehaltenen Eppendorf-Gefäßes auf den Parafilm drückt. Das Papier saugt sich hierdurch mit Pflanzensaft voll und muss nach Entfernen des Parafilms nur noch luftgetrocknet werden, um das Proben­material lagern zu können.

Für PCR-Analysen stanzt man mit einem Locher kleine Scheiben aus dem Lagerpapier mit den Blättern und transferiert diese direkt in ein PCR-Tube mit zwanzig Mikrolitern Reaktions­volumen. Nach den Angaben des Teams genügt es, den Locher zwischen den einzelnen Proben­entnahmen jeweils in ein leeres Filterpapier zu drücken, statt ihn abzuwaschen. Das mag daran liegen, dass nur der gequetschte Punkt nennenswerte DNA-Mengen enthält und der Locher vergleichsweise weiträumig um den Punkt herum schneidet.

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Für kurze DNA-Fragmente

Die Chinesen verwendeten für die PCR mit den Filterproben eine eigene Pufferrezeptur (Zehnfach-Konzentrat: 200 mM Tris pH 8,8; 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgCl2, 10% Triton) oder einen kommerziellen Puffer. Der fertige Reaktions­ansatz enthält neben dNTPs, Primern und Taq-Polymerase zusätzlich vier Prozent Tween-20.

Mithilfe der ausgestanzten Lagerkarten amplifizierte die Gruppe ein 500 Basenpaare langes DNA-Fragment. Die direkte PCR mit den selbst hergestellten Karten ist insbesondere zur Amplifikation kurzer DNA-Fragmente bis etwa 1.000 Basenpaaren-Länge geeignet, bei längeren Fragmenten lässt die Effizienz der PCR deutlich nach.

Andrea Pitzschke

Jia Z. et al. (2021): An efficient method for DNA purification-free PCR from plant tissue. Curr Protoc, 1(11):e289

Bild: Pixabay/Hans




Letzte Änderungen: 08.12.2021